1、Chapter 6萃 取Solvent Extraction,萃取的概念液液萃取从机理上分析可分为哪两类？常见物理萃取体系由那些构成要素？何谓萃取的分配系数？其影响因素有哪些？掌握单级萃取的过程。掌握多级萃取的萃取级。何谓超临界流体萃取？其特点有哪些？何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪些？反胶团的构成以及反胶团萃取的基本原理。,本章应掌握的内容,萃取是生物分离中常用的单元操作,固液分离,分离提取,纯化,精制,利用各种组分（包括目的产物）在两个互不相溶的液相中的溶解度或分配比不同，利用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。物理萃取化学萃取,何谓萃取,利用溶剂对需分离组分有较高
2、的溶解能力，分离过程纯属物理过程萃取体系的构成溶质：被萃取的物质原溶剂：原先溶解溶质的溶剂萃取剂：加入的第三组分萃取剂选择原则：使溶质在萃取相中有最大的溶解度,1.物理萃取,杂质,溶质,原溶剂,萃取剂,Light phase,Heavy phase,溶解现象本质,几个概念,料液：在溶剂萃取中，被提取的溶液。溶质：欲被提取的物质。萃取剂：用来进行萃取的溶剂。萃取液与萃余液：料液与萃取剂接触后，料液向萃取剂转移，达到萃取平衡后，大部分溶质转移到萃取剂中，含有溶质的萃取剂溶液称为萃取液，被萃取出溶质以后的料液称为萃余液。相：体系中具有相同物理性质和化学性质的均匀部分。,萃取法简介,广义溶剂萃取液固萃
3、取：浸取，固体溶质首先溶解于溶剂，然后由两相的界面扩散到溶剂中，多用于提取存在于细胞内的有效成分。例如：用丙酮从菌丝体内提取灰黄霉素液液萃取：溶剂与被处理的液体互相不混淆，但对液体中的组分有不同的 溶解能力，用一种溶剂将物质从另外一种溶剂（如发酵液）中提取出来的方法。,类型,提取目的将经过处理或破碎的组织放置于一定 条件下的溶剂中，使目标产物充分释放出来。浸渍：用冷溶剂从固体物质中提取过程。浸提（煮）：用热溶剂从固体物质中提取过程。浸取：用溶剂从液体中将某溶质取出。,萃取的优点,1 萃取过程具有选择性。2 能与其他需要的纯化步骤（如蒸馏）相配合。3 通过转移到不同的物理或化学特性的第二相中来减
4、少由于降解引起的产品损失。4 可从潜伏的降解过程中分离产物。5 适用于各种规模。6 传质速度快，生产周期短，便于操作。,物质的性质与提取方法的选择,物质性质溶解性质，分子量，等电点，存在方式，稳定性，比重，粒度，粘度，目的物含量，主要杂质种类及溶解性，有关酶类的特征。目的1、扩大目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性;2、增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度;3、重视生物材料及目的物在提取过程中的活性变化。,溶剂萃取的注意事项：（1）pH 在萃取操作中正确选择pH值很重要。因为在水溶液中某些酸、碱物质会解离，在萃取时改变了分配系数，直接影响提取效率pH=4，柠檬酸在庚酮中比在
5、水中更容易溶解，pH=5.5时青霉素在乙酸乙酯中比在水中溶解更快。2）盐析加入中性盐如硫酸铵，氯化钠等可以使一些生化物质的溶解度减少，这种现象成为盐析。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率。（3）温度 一般在室温下或低温下进行萃取操作。（4）乳化 在液液萃取时，常发生乳化作用，使有机溶剂与水相分层困难。去乳化的常用方法有：过滤与离心，轻轻搅动，改变两相的比例；加热，加电解质，加吸附剂。,操作原则,1、酶类生化产品要防止辅酶的丢失和其它失活因素的干扰；2、对蛋白质类生化产品要防止其高级结构的破坏，即变性作用，应避免高热，强烈搅拌，大量泡沫，强酸，强碱及重金属的作用；3、
6、对多肽类和核酸类生化产品要避免酶的降解作用，提取过程应该在低温下进行，并添加某些酶抑制剂；4、对脂类生化产品应该防止氧化作用，减少与空气的 接触，可添加抗氧化剂，通入氮气及避光等。,活性物质的保护方法,1 采用缓冲系统目的：防止某些酸、碱基团的解离导致溶液pH的大幅度变化，使某些活性物质变性失活或因pH变化影响提取效果常用缓冲系统：磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris缓冲液，醋酸缓冲液，碳酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液注意事项：降低缓冲液浓度以便增加溶质的溶解性能,活性物质的保护方法,2 添加保护剂目的：防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏常用保护剂：A 防止巯基被氧化的还原剂：半
7、胱氨酸，a巯基乙醇，还原型谷胱甘肽，二巯基赤藓糖醇等B 适量底物以保护活性中心；C 防止重金属离子抑制活性，添加金属螯合剂。,活性物质的保护方法,3*抑制水解酶的作用目的：抑制水解酶的活性，防止目的物被降解常见水解酶与抑制剂：A 只需要金属离子就可激活（如DNase）的水解酶 加入EDTA或用柠檬酸缓冲液，以降低或除去金属离子B 对热不稳定的水解酶可选择性热变性 C 溶解性不同的水解酶 可用 PH不同的 缓冲体系减少酶的释放或降低酶的活力,活性物质的保护方法,3*抑制水解酶的作用D 添加酶抑制剂 提取RNA时抑制核糖核酸酶可添加的抑制剂有：SDS（十二烷基磺酸钠），蛋白酶K，DEP，皂土，肝素
8、 提取活性蛋白和酶类时，加入蛋白酶抑制剂有：PMSF(甲基磺酰氟化物），二异丙基氟磷酸（DEP）、其它保护措施 避免紫外光，强烈 搅拌，过酸，过碱或 高温，高频率震荡 防止氧化，冷热交替变化,萃取法原理,分配定律（能斯特定律）在一定温度，一定压力下，某一溶质在互不相溶的两种溶剂间分配时，达到平衡后，在两相中的浓度之比为一常数，适用条件稀溶液溶质对溶剂的互溶度没有影响溶质在两相中必须是同一分子形式，不发生缔合或解离或络合。,萃取相浓度,萃余相浓度,衡量萃取体系是否合理的重要参数：y-平衡时溶质在轻相中的浓度X-平衡时溶质在重相中的浓度,分配系数,分配系数的对数值与标准状态下的化学势的差值有关,因
9、此，要提高溶质的分配系数，必须提高标准状态下，其在重相与轻相的化学势之差可以采取的方法：改变溶剂种类-萃取过程取决于溶剂的特性。改变溶质的特性生成有用离子对可溶于萃取剂的离子对（表9.5）将强酸弱碱盐或强碱弱酸盐生成弱酸弱碱盐通过改变原溶剂中的pH值（P138）,物质溶解度的规律,溶解度本质：固相分子间的相互作用及固液两相分子间两种作用力的综合平衡的结果。溶剂的作用：最大限度地削弱固相生物分子间的作用力，尽可能地增加目的分子与溶剂分子间的相互作用力。规律：“相似相溶”，一方面溶质与溶剂分子结构上的相似性，另一方面溶剂与溶质的分子间作用力相似。,溶剂的分类,依据：形成氢键的多少以及形成 氢键能力
10、的大小类别：1.能形成2个以上氢键的溶剂分子。如：水2.能形成2个氢键的溶剂分子。如：脂肪醇3.只能做质子受体的溶剂分子。如：脂肪簇的醚类4.只能做质子供体的溶剂分子。5.不能形成氢键的烃类。如：氯仿注：1，2可作为极性化合物的提取溶剂；3，4可作为溶液中弱极性或非极性化合物,萃取溶剂的选择依据,、利用溶解度参数理论指导溶剂的选择、根据相似相溶的规律选择、根据被提取物的介电常数（是摩尔极化程度的量度）来选择。,不同物质的介电常数,液液萃取时溶剂的选择：（1）选用的溶剂必须具有较高的选择性，各种溶质在所选的溶剂之间分配系数差异愈大愈好。（2）选用的溶剂，在萃取后，溶质与溶剂要容易分离与回收。(3
11、)两种溶剂的密度相差不大时容易形成乳化，不利于萃取液的分离。（4）要选用无毒，不易燃烧的价廉易的溶剂。,一、水也可作为溶剂：水是提取生化物质的常用溶剂。水分子的存在可使其它生物分子之间的氢键减弱，而与水分子形成氢键，水分子还能使溶质分子的离子键解离，这就是所谓的水合作用。水合作用促使蛋白质、核酸、多糖等生物大分子与水形成了水合分子或水合离子从而促使它们溶解于水或水溶液中。,1 高度极性化的极性分子，具有高度的介电常数。2 在水溶液中水分子自身形成氢键的趋势很强，分子内聚力（缔合力）强。3 水分子的存在可减弱其它生物分子间的氢键，而与水分子形成氢键。4 水分子可 解离溶质分子的离子键（水合作用）
12、。,二、用酸，碱，盐水溶液提取,作用：提取各种水溶性，盐溶性的生化物质原理：提供了一定的离子强度，pH值及相当的缓冲能力常见方法：1 用高浓度盐溶液（4mol/L盐酸胍，8mol/L尿素）2 用稀释的 硫酸提取胰蛋白酶,三、用表面活性剂提取,表面活性剂特点：兼有亲水与疏水基团作用（去垢剂）：在分布于水油界面时有分散，乳化和增溶作用。离子型表面活性剂作用强，但是易引起蛋白质等生物大分子的变性，非离子表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取。类型：阴离子型，阳离子型，中性与非离子性,乳化和去乳化,乳化现象一种液体以细小液滴（分散相）的形式分散在另外一种不相熔的液体（连续相
13、）中产生原因发酵液经过预先处理和过滤后，除去了大部分非水溶性的杂质和部分水溶性杂质，但残留的杂质如蛋白质等物质具有表面活性，引起乳化负面影响在有机相与水相的界面上形成一稳定的乳化层，使有机相与水相难以分层,乳化剂分子结构特点与类型,由亲油基和亲水基两部分组成，一端为亲水基团或极性部分（，等）一端为疏水性基团或非极性部分（烃链）以亲水基团是离子型还是非离子型为主要依据，可分为五大类：阴离子，阳离子，非离子，两性及高分子等,亲憎平衡值：每一种表面活性剂都有亲水和疏水基团，两种基团的强度的相对关系乳状液的类型水包油型 O/W油包水型 W/O,去乳化方法：,方法过滤离心分离电解质破坏双电层加热，稀释，
14、吸附加入其他表面活性剂将发酵液中表面活性物质除去,萃取方式,单级萃取只用一个混合器和一个分离器，将料液与萃取剂一起加入萃取器内，并用搅拌器加以搅拌，使两种液体均匀混合，在萃取器内产物由一相转入另外一相，分离得到萃取相和萃余相，萃取相送入回收器，在回收器中将溶剂与产物分离多级萃取由几个萃取器串联组成，料液经第一级萃取后分离成两个相，萃余相流入下一个萃取器，再加入新鲜萃取剂继续萃取；萃取相则分别由各级排出，混合在一起，再进入回收器回收溶剂,使含溶质的溶液（h）和萃取剂（L）解出混合，静止后分成两层。,单级萃取,连续逆流萃取装置,假定传质处于平衡状态有,y萃取相中溶质的浓度x萃余相中溶质的浓度由质量
15、守恒定律：,单级萃取过程的解析计算方法,由以上两式可得：,其中萃取因子：,若P为萃取回收率,三级错流萃取装置a艾德连式三级错流萃取装置b泵混合分离器三级错流萃取装置c加挡齐格勒接触器三级错流萃取装置d霍米莫脱接触器,混合沉降器旋转圆筒萃取塔离心萃取器填充塔喷雾塔旋转圆盘塔,常用萃取设备,离心萃取器,多级萃取是工业生产最常用的萃取流程分离效率高产品回收率高溶剂用量少,萃取法类型,1.溶剂萃取2.反胶束萃取3.双水相萃取4.超临界流体萃取5.化学萃取,反胶束萃取（Reversed Micelles Extraction）,表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体当表面活性剂浓度超过临界微团浓度
16、时，表面活性剂会在水溶液中形成聚集体微团和反微团,反胶束萃取几个概念,临界胶束浓度胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，与表面活性剂的化学结构，溶剂，温度和压力等因素有关正常胶束将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，此时的排列方向为极性基团在外，非极性基团在内反胶束将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过，便会在有机溶剂内形成聚集体，此时的排列方向为非极性基团在外，极性基团在内,微团：表面活性剂的极 性头朝外，疏水 的尾部朝内，中 间形成非极性的“核”,水,非极性的“核”,极性“头”,非极性“尾”,反微团：表面活性剂的极 性头朝内，疏水
17、的尾部向外，中 间形成极性的“核”,有机溶剂,极性“头”,极性的“核”,非极性“尾”,反胶束萃取原理（图）,反胶束形成，表面活性剂非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团排列在内形成一个极性核，具有溶解极性物质的能力蛋白质进入反胶束溶液时在两相界面的表面活性剂层，同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此反胶束扩散进入有机相中，从而实现蛋白质的萃取,蛋白质溶入反胶束溶液的推动力与分配特性,推动力表面活性剂与蛋白质的静电作用力位阻效应分配特性决定因素起始两相的结构和性能蛋白质进入反胶束后对反胶束的结构引起的变化,阴离子表面活性剂AOT阳离子表面活性剂季
18、铵盐,反微团的优点,优点.成本低，溶剂可反复使用，萃取率和反萃取率都很高。极性“水核”具有较强的溶解能力。.有可能解决外源蛋白的降解问题。生物大分子由于具有较强的极性，可溶解于极性水核中，防止与外界有机溶剂接触，减少变性作用。由于“水核”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，增加其结构的刚性，提高其反应性能。.反胶束的表面活性剂具有溶解细胞的能力。,反胶束萃取蛋白质的应用,分离蛋白质混合物浓缩淀粉酶从发酵液中提取胞外酶直接提取胞内酶反胶束萃取用于蛋白质复性,双水相萃取（Two aqueous phase extraction）,概念：通过不同的高分子溶液相互混合产生两相或多相系统，利用物质在互
19、不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法,在聚合物盐或聚合物聚合物系统混合时，各个聚合物分子倾向于在其周围有相同形状，大小和极性的分子。双水相的形成取决于：熵增与分子数目有关分子间作用力与分子大小有关，分子间结构上的不同产生的排斥力大于亲水性的吸引力时，得到均质的相。可以构成双水相的体系有：离子型高聚物非离子型高聚物（分子间斥力）PEGDEXTRAN高聚物相对低分子量化合物（盐析作用）PEG硫酸铵,双水相萃取原理,溶质在两水相间的分配主要有其表面性质决定，通过在两相间的选择性分配而得到分离，分配系数主要取决于相系统的性质，被萃取物的表面性质和温度，与溶质的浓度和相体积比无关,双水相体系直
20、接萃取牛血清,依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相互作用：氢键电荷力疏水作用范德华力构象效应,双水相萃取的原理,双水相系统的类型 参考表2,双水相萃取优点,.操作条件温和，在常温常压下进行；可保留产物的活性.两相的相比随操作条件而变化，整个操作可连续化，处理量大，适合工业应用。3.两相的界面张力小，一般在10-4Ncm量级，两相易分散。4.在除去细胞或碎片时还可以纯化蛋白质倍上下两相密度差小，一般在10 g/L。因此两相分离较困难，目前这方面研究较多目前应用：酶和核酸分类与纯化，生物工程药物如人生长激素、干扰素等，蛋白质，和病毒等产品的分离纯化和分析,影响双水相萃取的因素(双水相系统中目标物
21、分配系数的影响因素),聚合物的组成成相高聚物的相对分子量一般来说，蛋白等高分子量物质易集中于低分子量相物理化学性质成相高聚物浓度界面张力.电化学分配双水相萃取时，蛋白质的分配系数受离子强度的影响很小盐和缓冲液疏水反应生物亲和分配温度及其它因素,双水相萃取的放大与设备,蝶片式离心机和喷嘴分离机倾析器离心机柱式接触器,双水相萃取技术的进展1.廉价双水相体系的开发-离子液体材料；2.与其它技术的有机结合，提高分离效率。A:与生物转化的结合B：与膜技术的结合C：与亲和层析的结合,超临界流体萃取-是基于一种溶剂对液体或固体的萃取能力和选择性，在超临界状态下比常温常压下和获得极大的提高。温度和压力略超过或
22、靠近临界温度和临界压力介于液-气体之间的流体，作为萃取剂，从液体或固体中萃取出某种高沸点或热敏性成分，达到分离与纯化的目的。超临界流体：当一种流体处于其临界点的温度和压力之下，则称之为超临界流体。特点：密度接近液体萃取能力强 粘度接近气体传质性能好,超临界流体萃取（气体萃取Gas extraction;蒸馏萃取、压力流体萃取）(Supercritical Fluid Extraction),利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下，与待分离的物料接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，使萃取物得到分离常用萃取剂极性萃取剂：乙醇、甲醇、水（难）非极性萃取剂：二氧化碳（易）,超临界流体
23、萃取的基本思想,临界点：T：304.1KP：7.38 Mbar优点：缺点：临界条件温和 设备投资大产品分离简单无毒、无害不燃无腐蚀性价格便宜,超临界二氧化碳萃取（Supercritical Carbon Dioxide Extraction）,超临界二氧化碳萃取流程图,硫酸丁三酯,等温法等压法吸附法,超临界萃取典型流程,咖啡因萃取植物油：胚芽油、玉米油、亚麻酸天然香料：杏仁油、柠檬油啤酒花尼古丁,超临界流体的应用,大型超临界流体萃取装置,利用可与被萃目标物发生反应的非极性物质作为萃取剂进行的反应络合萃取分离有机酸（醋酸）季铵盐叔胺络合萃取体系构成萃取剂稀释剂,二、化学萃取（Chemical Extraction）,离子对(ion-pair),氢键(H-bonding),离子交换(ion exchange),