1、解螺旋陪伴医生科研成长 http:/ 1 3 3D D 肿瘤球形成实验肿瘤球形成实验 1.1.实验原理实验原理 肿瘤球(tumor sphere)是肿瘤细胞在无血清的培养条件下经表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）等多种细胞生长因子诱导形成的悬浮生长的细胞团块。肿瘤球用于肿瘤方面的研究已有 40 余年，被公认为肿瘤研究最好的细胞模型之一。肿瘤球的直径一般超过 400 m，由不断增生的外层细胞和由于氧气和营养物质传输的限制而处于静止期的内层细胞构成。与传统的单层平面
2、培养的肿瘤细胞相比，肿瘤球的三维空间结构可以为体外生长的肿瘤细胞提供类似体内生长环境的生物支撑或基质，并建立细胞之间及细胞与细胞外基质间相互联系。传统的单层平面培养的肿瘤细胞则由于结构过于简单，缺乏合适的生理学载体和结构力学特性，与体内正常生长的细胞相距甚远。因此，在肿瘤的侵袭、转移的体外研究和药物的高通量筛选方面，肿瘤球已经逐步代替平面培养的肿瘤细胞成为肿瘤体外研究中常用的模型之一，同时，肿瘤细胞悬浮成球实验被认为是获取具有干性肿瘤细胞的试验之一。2.2.实验目的实验目的 通过少量细胞能否持续形成 3D 肿瘤球来判断肿瘤细胞的增殖能力和细胞干性。3.3.实验实验材料材料 3.1.3.1.主要
3、试剂主要试剂 培养基（可根据细胞选择，见细胞系列表），0.25%EDTA 的胰酶，灭菌的 1 x PBS，2%B27，1%N2,20 ng/ml 人源的 bFGF 和 50 ng/ml 重组人源的 EGF，4g/ml heparin（可选）。解螺旋 http:/ 细胞培养箱，离心机，培养皿，低粘附 6 孔板或者 24 孔板，电动/普通移液枪，计数器。3.3.3.3.其他其他 sphere 在静止的悬浮状态下是不会动的。建议先用显微镜取几个视野拍照后再计数。解螺旋陪伴医生科研成长 http:/ 2 4.4.实验步骤实验步骤（以（以胰腺癌细胞胰腺癌细胞 3D3D 肿瘤球形成肿瘤球形成实验为例实验为
4、例）1.将处于对数生长期的胰腺癌细胞用 0.25%EDTA 的胰酶消化，并 1xPBS 清洗一遍，用基础培养基 解螺旋 http:/ 个胰腺癌细胞均匀铺在 24 或者 6 孔的超低黏附细胞培养皿（取决于自己的实验具体条件，原则是不能让细胞长的过满。40 天以后照相要清晰可见不同的 3D 肿瘤球。也不能铺太少的细胞，比如 xx 基因敲除掉的细胞本来长的就慢。）。3.去血清处理的培养基包含 2%B27，1%N2,20ng/ml 人源的 bFGF 和 50ng/ml 重组人源的 EGF,培养细胞 7 到 10 天，中间 3-4 天换一次培养基。4.更换培养基时候，把已经形成的肿瘤球用 1ml 的枪头
5、吸附到试管中，用 1xPBS 清洗 2次，去除 1xPBS,加入 0.25%胰酶消化，离心 1200rpm,2min,并且重新铺细胞到 24 孔或者 6 孔细胞培养皿培养 7-10 天，如此反复 4 次，约 30-40 天，如果打散的细胞能持续形成肿瘤球，则说明此肿瘤细胞有自我增殖能力，或者说是细胞干性。5.肿瘤球大于 30um 的在电镜下观察和计数其数量，至少 3 个复孔。注意：注意：A.不同类型的肿瘤细胞要找到合适的铺板数，比如肝细胞可以铺 5000 个细胞。B.培养基也因为不同细胞而变化，常见的还有 DMEM 等。C.胰酶如果用普通的，不是 0.25%也可以，但是消化时间长，会损伤些细胞。5.5.参考文献：参考文献：1 1 1.Zhao S,Chen C,Chang K,et al.CD44 Expression Level and Isoform Contributes to Pancreatic Cancer Cell Plasticity,Invasiveness,and Response to Therapy.Clin Cancer Res 2016;2222(22):5592-604.