1、 （），（）：乔若飞，李俊杰，梁舒涵，等 补阳还五汤对 大鼠脊髓损伤后、表达的影响 中医药导报，（）：，（）：，（），（）：，：，（）：收稿日期：；修订日期：基金项目：河北省中医药管理局科研计划项目（）作者简介：张欣欣（），女（汉族），河北保定人，河北中医学院在读博士研究生，硕士学位，主要从事中西医结合肾病研究工作通讯作者简介：檀金川（），男（汉族），河北石家庄人，河北省中医院教授，博士研究生导师，博士学位，主要从事中西医结合肾病研究工作大黄泄浊方对 肾切除大鼠肾脏保护作用及对 通路的影响张欣欣，辛 鑫，吴振华，檀 淼，杨凤文，张翠轻，任美芳，赵美姣，陈素枝，檀金川，（河北中医学院，河北 石家
2、庄；河北省中医院，河北 石家庄；河北医科大学第四医院，河北 石家庄）摘要：目的 通过观察大黄泄浊方对慢性肾衰竭大鼠内质网应激凋亡途径相关蛋白的影响，探讨其延缓肾间质纤维化的可能作用机制。方法 只 雄性健康大鼠随机分为假手术组，模型组，大黄泄浊方低、中、高剂量组（、）和尿毒清颗粒组（），除假手术组外其余分组大鼠均采用 肾切除术造模。模型诱导成功后，各药物干预组分别给予规定剂量的中药混悬液灌胃，每日 次，连续 周。给药结束后，检测大鼠血清中血肌酐（）、血尿素氮（）、血白蛋白（）水平及大鼠 尿蛋白定量（）水平；苏木素 伊红（）、马松（）染色观察肾脏病理学改变；实时荧光定量（）检测大鼠肾组织中 平滑肌
3、肌动蛋白（）、胶原蛋白（）的相对表达量情况；免疫组织化学法（）检测肾组织中 淋巴细胞瘤（）蛋白、大分子 淋巴细胞瘤（）蛋白、相关 蛋白（）、基因相关启动子重组蛋白（）的表达情况；蛋白免疫印迹法（）检测肾组织中蛋白激酶 样内质网激酶（）、转录激活因子（）、转录因子 同源蛋白（）蛋白的表达情况。结果 与假手术组相比，模型组大鼠血、水平显著增高（），水平显著降低（），水平显著增高（），肾组织中 、相对表达量显著增高（），、表达水平显著降低（），、蛋白表达水平显著增加（）；与模型组相比，各药物干预组血、水平均有不同程度降低（），水平均有不同程度增高（），水平均有不同程度降低（），肾组织中 、相对表达量
4、均有不同程度降低（），、表达水平均有不同程度增高（），、蛋白表达均有不同程度降低（）。结论 大黄泄浊方可改善肾功能、延缓肾纤维化，其机制可能是通过调控 通路相关蛋白的表达，抑制内质网应激，减少细胞凋亡有关。关键词：大黄泄浊方；肾切除；肾纤维化；内质网应激；蛋白激酶 样内质网激酶（）转录激活因子（）转录因子 同源蛋白（）信号通路 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）慢性肾衰竭（，）是各种原发性或继发性慢性肾脏疾病（，）进展到终末期肾病（，）阶段，肾小球滤过功能进行性下降，进而表现出全身代谢紊乱及多系统多器官受累的相关症状的临床综合征。某地区一项单中心 年的流行病学调查显示，确诊为 并进行
5、血液透析的患者逐年增加，透析患者生存率随着透龄增加而下降。预后较差，给人类健康带来重大挑战。目前针对 的治疗主要集中在对因、对症及营养支持治疗等方面，严重者不得不进行透析及肾脏移植等疗法，但透析并发症较多，肾移植费用昂贵且面临严重器官移植排斥反应，降低了患者生活质量，同时加重了社会及家庭经济负担。肾纤维化（，）是各种肾脏病进展到一定阶段的共同病理表现，是肾脏结构损害和肾功能障碍的重要原因之一，。因此，减轻 进程对于减缓 进展和保护肾功能具有意义重大。已有研究表明，内质网应激（，）诱导的细胞凋亡在 进程中扮有重要角色，适度的 对于维持内质网稳态、细胞存活和延缓 至关重要；但过强的 会诱导肾脏实质
6、细胞发生凋亡，增加肾脏结构不可逆性损伤，加速 的进展。时珍国医国药 年第 卷第 期 诸多研究表明，单味中药或中药复方可以有效延缓肾纤维化、减轻肾损伤和延缓肾衰进程。大黄泄浊方是河北省名中医檀金川教授总结多年临床实践经验，针对肾衰患者“脾肾两虚、湿热瘀蕴结”的病机要点，以健脾补肾、清热利湿、化瘀通络、泄浊解毒为基本治疗法则，提出的治疗 的常用中药复方，由大黄、黄芪、土茯苓、水牛角丝、丹参、当归、醋龟甲、地龙、积雪草组成，临床应用时发现可有效降低患者血肌酐、血尿素氮、尿蛋白水平，但具体的作用机制尚不明确。蛋白激酶 样内质网激酶（，）转录激活因子（，）转录因子 同源蛋白（，）是 诱导凋亡的主要途径之
7、一，本研究通过观察大黄泄浊方对 肾切除大鼠内质网应激凋亡途径相关蛋白的影响，探讨其改善肾功能、延缓肾纤维化进程的可能机制，为临床广泛运用提供科学依据。材料与仪器 动动物物 只 级别健康雄性的 周龄的 大鼠，体质量（），均购自辽宁长生生物技术有限公司（许可证书编号为（辽），饲养于河北中医学院 级实验动物中心（伦理审查编号为），自由进食高压灭菌普通 饲 料（河 南 环 宇 哥 禾 康 生 物 技 术 有 限 公 司，批 号）和自由饮水。药药物物 大黄泄浊方（大黄，黄芪，土茯苓，水牛角丝，丹参，当归，醋龟甲，地龙，积雪草），由广东一方制药 有 限 公 司 提 供 中 药 配 方 颗 粒（批 号 分
8、别 为、）；尿毒清颗粒，规格 袋，内蒙古康臣药业有限责任公司生产，国药准字。试试剂剂 血尿素氮（）、血肌酐（）、血白蛋白（）、尿蛋白定量（）检测试剂盒（南京建成生物，批号分别为、）；染色液（北京雷根生物科技有限公司，批号为）；、逆转录试剂盒、实时荧光定量 试剂盒（美国 公司，批号分别为、）；兔来源一抗 淋巴细胞瘤（）、基因相关启动子重组蛋白（）、相关 蛋白（）、大分子 淋巴细胞瘤（）、转录因子 同源蛋白（）（美国 公司，批号分别为，）；兔来源一抗蛋白激酶 样内质网激酶（）、转录激活因子（）（美国 公司，批号分别为、）；二抗（美国 公司，批号）。仪仪器器 型可见分光光度计，上海第三分析仪器厂；全
9、自动生化仪，日本日立公司；显微镜，日本奥林巴斯公司；型切片机，德国 公司；成像系统，美国 公司；实时荧光定量 仪，美国 公司；型电泳系统、转移系统，美国伯乐公司。方法 动动物物模模型型制制备备 按照 肾切除法制备 大鼠模型。的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，将其固定在手术台上，左侧背部剪毛备皮、常规消毒，距左肋脊角 处做一纵向皮肤切口（长约），逐层分离皮肤各层进入后腹腔，暴露左肾，分离肾脏并用动脉夹结扎肾蒂，切除以肾皮质为主的 肾组织，明胶海绵垫压迫止血，缝合切口并进行包扎，为预防感染，术后腹腔注射青霉素。周后按照上述方法进行第 次手术行右肾全切术。术后 周，随机抽取 只假手术组和 只造模组化验检
10、测、水平，与假手术组大鼠比较，、水平显著升高，处死留取肾脏标本进行 染色观察肾脏病理形态，与假手术组大鼠比较，造模组大鼠肾脏组织有明显的纤维化，提示模型制备成功。动动物物分分组组及及给给药药 只雄性 大鼠适应性喂养 周，采用随机数字表法随机分为假手术组，模型组，大黄泄浊方组（低、中、高剂量）和尿毒清颗粒组，每组均 只。假手术组仅做双肾被膜剥离术。其余 只 大鼠均按照 肾切除复制 模型。依据人与大鼠体表面积法换算临床等效剂量，大黄泄浊方中剂量给药量为 ，以中剂量的、倍分别为低剂量、高剂量，即大黄泄浊方低剂量、高剂量给药量分别为、；尿毒清颗粒组给药量为；均按照大鼠 的体质量灌胃给药，每日 次，连续
11、 周。假手术组和模型组在同等时间给予同等剂量的蒸馏水灌胃。指指标标检检测测 血血生生化化指指标标及及 定定量量的的检检测测 麻醉大鼠并腹主动脉取血，室温放置，离心分离血清，采用全自动生化分析仪检测大鼠血清中、水平；留取大鼠 尿液，采用尿液分析仪检测尿蛋白水平。所有检测指标均严格按照试剂盒的要求进行。、染染色色检检测测肾肾脏脏病病理理学学改改变变 将固定于 多聚甲醛中的肾组织取出，乙醇梯度脱水、透明组织、石蜡包埋，连续切片，切片厚度为 并进行、染色，光学显微镜下观察肾脏病理学改变并拍照。检检测测肾肾组组织织中中 、的的 表表达达水水平平 将 的残余肾组织取出充分研磨，加入 提取总，逆转录合成，配
12、制反应体系，加入特异性引物进行 扩增，扩增条件为：预变性（第一阶段），变性、退火、延伸（第二阶段），、（第三阶段），个循环。以 为内参，使用 计算 的相对表达量，引物由武汉 公司设计合成。表 引物序列引物名称引物序列（）引物大小 上游：下游：上游：下游：上游：下游：免免疫疫组组化化法法检检测测肾肾组组织织 、蛋蛋白白的的表表达达情情况况 取固定于 多聚甲醛的适当肾组织进行石蜡包埋切片，乙醇脱蜡、水化，细胞通透，抗原修复，的山羊血清 封闭，弃掉羊血清滤纸吸附后加入稀释好的一抗工作液，孵育过夜；室温复温，弃掉一抗，洗涤 次后滴加稀释好的二抗工作液，孵育。清洗 次后，避光显色，目标蛋白会被棕黄色，以
13、其为阳性结果信号出现为止，后进行水洗、苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片。使用 软件计算每个视野下阳性结果的积分光密度和面积，以积分光密度 面积作为检测指标的半定量结果。检检测测肾肾组组织织中中 、蛋蛋白白的的表表达达量量 将 冰箱中的残余肾组织取出，低温自动高速研磨机辅助研磨，加入蛋白裂解液冰上裂解，、离心（离心半径为），后取上清用 法进行蛋白定量。水浴锅水浴蛋白变性，取 蛋白样品使用 凝胶进行电泳分离，转 膜，洗膜后封闭液室温封闭，滴加稀释好的一抗，孵育过夜。洗膜，加入稀释好的二抗，室温孵育，洗膜后 电化学发光法显色，凝胶成像系统扫描，用 图像分析软件进行灰度值分析。时珍国医国药 年第
14、卷第 期 统统计计学学分分析析 采用 统计软件进行数据处理和数据分析。符合正态分布的计量资料数据采用均数 标准差（?）表示，否则用中位数表示。所有分组数据均进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析（）进行多组总均值的比较，组间的两两多重比较采用 法；若不满足正态或方差齐，则采用非参数检验。以 提示差异有统计学意义。结果 各各组组大大鼠鼠的的一一般般情情况况 假手术组大鼠精神状态尚佳，喜动，毛发有光泽，体重随周龄增加逐步稳定增长，进食量多。模型组大鼠嗜睡倦怠，喜抱团，蜷缩喜卧，活动量减少，体重增长缓慢，进食量明显减少，毛发无光泽，尿量减少，大便量减少，部分大鼠还出现四肢水肿、阴囊水肿的情况
15、。大黄泄浊方各剂量组和尿毒清颗粒组大鼠上述情况较模型组大鼠均有不同程度改善，其中大黄泄浊方中、高剂量组改善较低剂量组和尿毒清颗粒组明显。大大黄黄泄泄浊浊方方对对 大大鼠鼠血血 、及及 水水平平的的影影响响 与假手术组比较，模型组大鼠血清中、水平显著升高（），血 水平显著降低（），水平明显升高（）。与模型组比较，大黄泄浊方各剂量组和尿毒清颗粒组大鼠血清中、水平均有不同程度降低（），血 水平均有不同程度增高（），水平均有不同程度降低（），其中大黄泄浊方中、高剂量组疗效明显优于大黄泄浊方低剂量组和尿毒清颗粒组（）。见表。表 大黄泄浊方对 大鼠血、及 水平的影响（?）组别剂量 （）假手术组 模型组 ）
16、大黄泄浊方低剂量组 ）大黄泄浊方中剂量组 ）大黄泄浊方高剂量组 ）尿毒清颗粒组 ）与假手术组相比，）；与模型组相比，）；与大黄泄浊方低剂量组相比，）；与尿毒清颗粒组相比，）；大大黄黄泄泄浊浊方方对对 大大鼠鼠肾肾脏脏病病理理形形态态改改变变的的影影响响 与假手术组比较，模型组大鼠肾组织中肾小管明显扩张，部分可有空泡样变性，肾间质可见明显炎性细胞浸润及蓝色胶原纤维沉积。与模型组比较，大黄泄浊方各剂量组和尿毒清颗粒组肾小管和肾间质损伤情况有不同程度减轻，其中大黄泄浊方中、高剂量组改善明显。见图、图。：假手术组；：模型组；：大黄泄浊方低剂量组；：大黄泄浊方中剂量组；：大黄泄浊方高剂量组；：尿毒清颗粒组图 大黄泄浊方对 大鼠肾脏病理形态改变的影响（染色，）大大黄黄泄泄浊浊方方对对 大大鼠鼠肾肾组组织织中中 、表表达达水水平平的的影影响响 与假手术组比较，模型组大鼠肾组织中 、相对表达量明显增高（）；与模型组比较，大黄泄浊方各剂量组和尿毒清颗粒组大鼠肾组织中 、相对表达量均有不同程度降低（），其中大黄泄浊方中、高剂量组降低程度明显优于低剂量组和尿毒清颗粒组（），而尿毒清颗粒组改善程度明显优于大黄