1、大连市 2020 年甲型肝炎病毒流行株基因特征杨月1，朱琳1，杨芳2，韩一楠1，尹文娇3，4，曹经瑗3，4，毕胜利3，4(1大连市疾病预防控制中心，辽宁 大连 116021;2庄河市疾病预防控制中心，辽宁 庄河 116400;3国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室，北京 102206;4中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京 102206)DOI:10.19914/j.CJVI.2023009通信作者:韩一楠，Email:hanyinan hotmailcom;尹文娇，Email:yinwj_cdc 126com第一作者 Email:yangyue83921 163com摘要:目的
2、 分析大连市甲型肝炎(甲肝)病毒(Hepatitis A virus，HAV)流行株基因特征。方法 采集大连市 2020 年部分甲肝病例急性期血清或粪便标本，提取 HAV 核酸，采用巢式 T-PC 扩增目的基因，构建 HAV 获得序列与GenBank 中参考序列的系统进化树，分析 HAV 序列 VP12A 区核苷酸和氨基酸同源性，确定基因型。结果 从甲肝病例标本中获得 54 条 HAV 序列，核苷酸、氨基酸同源性分别为 97.15%100%、98.13%100%，属于A 基因亚型。获得序列与中国大陆序列中 2014 年辽宁省丹东市、20192020 年山东省烟台市和威海市序列的核苷酸同源性最高
3、，为 98.42%99.69%;与其他国家序列中日本、意大利 HAV 序列的核苷酸同源性最高，为 99.07%100%。在获得序列中，53 条序列的氨基酸同源性为 100%，1 条序列与其存在 2 个氨基酸差异。结论 大连市 2020 年 HAV 优势流行株为A 基因亚型，甲肝可能具有多个传播链和相同感染来源。HAV 基因型监测有助于 HAV 溯源和及时采取应对措施。关键词:甲型肝炎;甲型肝炎病毒;基因型;同源性中图分类号:183.4文献标识码:A文章编号:1006916X(2023)01004706Genetic characteristics of hepatitis A virus st
4、rains circulating in Dalian，2020Yang Yue1，ZhuLin1，Yang Fang2，Han Yinan1，Yin Wenjiao3，4，Cao Jingyuan3，4，Bi Shengli3，4(1Dalian MunicipalCenter for Disease Control and Prevention，Dalian 116021，Liaoning，China;2Zhuanghe Municipal Centerfor Disease Control and Prevention，Zhuanghe 116400，Liaoning，China;3Na
5、tional Health CommissionKey Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases，Beijing 102206，China;4National Institute forViral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China)Abstract:Objective To determine genetic characteristics of hepatitis A
6、 virus(HAV)strains circulatingin Dalian cityMethods We collected serum or fecal samples from acute hepatitis A cases in 2020 inDalian to extract HAV nucleic acid，amplify target genes using nested T-PC，and construct aphylogenetic tree of the sequences with reference strain sequences from GenBank We a
7、nalyzed nucleotideand amino acid homologies in the VP12A regions and identified genotypes esults Fifty-four HAVsequences were obtained and identified as sub-genotype A，with nucleotide and amino acid homologiesof 97.15%100%and 98.13%100%，respectively The Dalian sequences had the highest nucleotidehom
8、ologies(98.42%99.69%)with sequences obtained in Dandong，Liaoning province in 2014 andYantai and Weihai cities of Shandong province in 20192020 compared with other sequences obtained inChina s mainland The Dalian sequences had the highest homologies(99.07%100%)with sequencesobtained in Japan and Ital
9、y compared with sequences obtained in other countries Of the 54 sequences，53 had 100%amino acid homology and one differed by two amino acidsConclusions The dominant HAVstrain was sub-genotype A in 2020 in Dalian Hepatitis A may have multiple transmission chains withsimilar infection sources Monitori
10、ng HAV genotypes may help trace sources of HAV and facilitate rapid74中国疫苗和免疫 2023 年 2 月第 29 卷第 1 期responseKey words:Hepatitis A;Hepatitis A virus;Genotype;Homology甲型肝炎(甲肝)主要通过饮用或食用被甲肝病毒(Hepatitis A virus，HAV)污染的水或食物、与甲肝病例日常生活接触等途径传播，偶经血液和血液制品传播1，近年文献报道在同性恋人群和流浪者中发生甲肝暴发疫情2，3。HAV 属于小 NA 病毒科肝病毒属，单股正链 N
11、A，长约 7.5kb，含有 1 个开放读码框架，编码由 2 227 个氨基酸组成的大蛋白，大蛋白又被切割为结构蛋白和非结构蛋白4，5。根据结构非结构蛋白编码区 VP12A 区核苷酸序列差异，HAV 分为 6 个基因型，其中基因型、分别分为A 和B、A 和B、A 和B 基因亚型，来源于人类;基因型、来源于猿猴。同一基因型之间核苷酸序列差异15%，同一基因亚型之间核苷酸序列差异7.5%4，5。HAV 只有一个血清型，氨基酸序列较为保守。HAV 没有包膜，对外界环境抵抗力强，耐酸和高温。大连市自 2001 年出现甲肝流行高峰后，甲肝发病率总体呈下降趋势，尤其是 2008 年甲肝减毒活疫苗纳入国家免疫
12、规划后，年均报告发病率为 5.47/10 万6，7;但 2016 年和 2020 年发病率回升，分别为10.52/10 万和9.69/10 万，持续高于 2020 年中国平均报告发病率水平(1.06/10 万)8。本研究分析了大连市 2020 年部分甲肝病例 HAV 流行株基因型特征，为大连市 HAV 溯源和甲肝防控提供技术支撑。材料与方法1标本采集2020 年 47 月对大连市庄河地区医疗机构收治的 54 例甲肝住院病例，采集入院后 13d 血清和粪便标本，送中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所实验室，于20冰箱保存备检。2抗HAV IgM 检测采用捕获法酶联免疫吸附试验检测血清抗HAV I
13、gM 抗体，试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司。3HAV 核酸提取血清标本:使用 Qiagen 公司的 QIAampViral NA Mini Kit(货号 52904)试剂盒，从 140L 血清中提取 HAV NA，最后用60L Buffer AVE 洗脱。制备10%(w/v)的粪便悬液，取 0.1g 粪便标本至 1.5mL 离心管中，加入浓度为 0.01M 的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)至 1mL，充分振荡混匀，静置 10min，以 8 000rpm 离心 10min，获取上清;使用中国台湾 Geneaid 公司的 Viral Nucleic Acid Extraction k
14、it 试剂盒(货号 V100)，取 200L 上清提取 HAV NA，最后用50L Nase-free 水洗脱。操作步骤均按照试剂盒说明书进行。4HAV 荧光 T-PC 检测根据文献9，使用日本 Takara公司的 One Step PrimeScriptTMT-PC Kit(Perfect eal Time)(货号 064A)试剂，进行 HAV 荧光 T-PC 检测。20L反应 体 系 中 含 模 板 NA 5L，上 游 引 物 F(5 GGTAGGCTACGGGTGAAAC 3)、下 游 引 物(5 CCTCCGGCGTTGAATGGTTT 3)和 探 针 Probe(5 FAM-ACAG
15、CGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGA-BHQ3)的终浓度分别为 0.4M、0.4M 和 0.2M。实时荧光定量 PC 仪(QuantStudio 5)购自美国 Thermo Fisher 公司。反应条件:42 30min，95 10s;95 5s，60 34s，40 个循环。检测 Ct值37 判定为阳性，37Ct 值38 为不能判定，Ct 值38 判定为阴性。5巢式 T-PC 扩增 HAV 基因序列和序列测定根据文献10，使用日本 Takara 公司的 PrimeScriptTMOne Step T-PC Kit Ver2.0 试剂盒(货号 055A)，进行逆转录和第一轮 PC
16、。按照试剂盒说明书，配制 50L 反应体系:原始浓度为 10M 的第一轮上游引物 CF1(5 GACAGATTCTACA-TTTGGATTGGT 3)和 下 游 引 物 C1(5 CCATTTC-AAGAGTCCACACACT3)各 2L，NA 模板 5L。反应条件:50 30min，94 2min;94 30s，50 30s，72 30s，35个循环;72 10min，4 保存。第二轮 PC:按照 PremixTaqTM(TaKaa TaqTMVersion 2.0 plus dye，货号 901A)说明书，配制 50L 反应体系:原始浓度为 10M 的第二轮上游引物 CF2(5CTATTCAGATTGCAAATTACAAT3)和下游引物 C2(5AACTTCATTATTTCATGCTCCT3)各 2L，第一轮 PC 产物 2L。反应条件:94 2min;94 30s，50 30s，72 30s，35 个循环;72 10min，4保存。通过 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定第二轮 PC 产物，阳性条带约为 392bp，将片段大小正确的 PC 产物送生工生物工程(上海)股份有限公司，采用第二轮上