1、第 卷第 期 河 南 城 建 学 院 学 报 年 月 收稿日期：基金项目：国家自然科学基金（）作者简介：叶延欣（），男，河南叶县人，博士，讲师，研究方向：食品发酵技术。通信作者：徐振上（），男，河北邢台人，博士，硕士生导师，研究方向：食品微生物技术。文章编号：（）：大肠杆菌分泌表达纳豆激酶及体外溶栓特性分析叶延欣，李蕾蕾，宋书涵，张 杰，刘亚琼，洪 军，徐振上（河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山；河南省健康食品工程技术研究中心，河南 平顶山；齐鲁工业大学 生物工程学院，山东 济南）摘 要：以 基因组为模板，克隆出纳豆激酶（，）前导肽与成熟肽编码基因（），并采用同源重组方法将其与已报
2、道的功能肽编码基因 或 及线性化质粒 构建出重组表达载体 与 ，并转化于 （）中进行诱导表达。经 诱导表达后，实现了重组 在大肠杆菌中的重组表达并具有生物活性，但 仅检测到重组酶 的可分泌表达及其具有酶催化活性，酶活力为（），体外溶栓实验也表明该重组酶 具有良好的体外溶栓效果，表明 有助于介导蛋白 可活性分泌表达。关键词：纳豆激酶；同源重组；分泌表达；酶催化活性；体外溶栓中图分类号：开放科学（资源服务）标识码（）：文献标识码：，（，；，；，）：，（），（），（），：；纳豆激酶（，）是一种具有较强纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，可降解纤维蛋白，已有研究表明其溶血栓能力明显强于尿激酶、链激酶及蚓激酶等具有
3、一定副作用的溶血栓药物，并具有预防和治疗心血管疾病的功能，从而使 成为一种很有潜力的新型溶栓药物。但在自然条件下 生产菌株产量通常较低，发酵时间长，大多数研究者已采用基因工程技术构建高效表达 的基因工程菌，以期提高 产量。虽然科研者已采用不同的基因工程菌高效表达，但不同的表达系统特性有所差异，的表达产量及酶活力均有不同，例如：枯草杆菌表达系统表达杂蛋白多，产物不易进行纯化分离；毕赤酵母表达系统的表达蛋白纯度高，但存在表达蛋白活性低，表达量相对较小的缺点。而大肠杆菌表达系统具有表达量相对较高，蛋白易纯化等优点，不少研究者虽已尝试利用大肠杆菌表达，但表达产物多以包涵体形式存在，故大肠杆菌表达系统不
4、能理想地表达 基因。但随着研究的深入，发现来源芽孢杆菌的纤维素内切酶催化结构域 或来源于噬淀粉乳杆菌的阿魏酸酯酶（简称“”与“”）的 端前 个氨基酸，可有助于内源或异源蛋白在大肠杆菌（）中通过某一已知或未知的途径被分泌至胞外，且胞外产量较高。由于这 个氨基酸的分子量较小，对底物蛋白的干扰较小，具有较好的引导蛋白分泌于胞外的应用价值。本文以经筛选的产纳豆激酶菌株 为出发材料，克隆出 编码基因，并采用同源重组方法将其与已报道引导蛋白分泌的功能肽编码基因“”或“”及表达载体 重组，分别构建出重组表达载体 与 ，并转化于 （）中，经诱导表达后测定胞外酶催化活性及评估其体外溶栓作用，实现 在 （）中的活
5、性分泌表达，为进一步提高 产量和酶活力奠定基础。材料与方法 材料 菌株及质粒纳豆芽孢杆菌（）由本实验室前期筛选保存；、（）与质粒 由本实验保存。试剂 、质粒 提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、（，等）购于诺唯赞生物科技股份有限公司；限制性内切酶 与 购买于 ；、核酸染色剂 等均购于北京索莱宝科技有限公司。其他试剂均为进口或国产分析纯。实验方法 引物设计与基因合成依据已报道的纤维素内切酶催化结构域 和来源于噬淀粉乳杆菌的阿魏酸酯酶 的编码序列确定了能引导分泌功能肽编码基因（分别简称“”和“”），其具体序列如下：基 因 序 列：；基 因 序 列：。将序列发送至江苏金唯智生物科技有限公司进行合成。参考同源
6、重组试剂盒（）的操作流程，对 扩增目的基因引物进行设计，其中扩增 编码基因 的引物对为 ，扩增 和 的引导分泌功能肽 河南城建学院学报 年 月编码基因引物对分别为 与 ，其具体的序列如表 所示，并发送至江苏金唯智生物科技有限公司进行合成。表 引物序列引物名称引物序列（）注：粗体分别为相应的衔接基因的同源序列，可分别构建出重组载体 与 ，粗体 斜体为 酶切序列以及 酶切序列。分泌表达载体的构建 反应分别以 基因组、基因合成的 或 为模板，引物对 、或 ，在 作用下分别进行扩增 编码基因、和。反应的条件为：预变性 后，变性 ，退火 ，延伸，共进行 个循环。所有循环结束后于 延伸 ，用 琼脂糖凝胶电
7、泳检测扩增产物及 凝胶回收试剂盒进行目的基因片段的纯化回收。采用碱裂解法从 中提取质粒 并对其进行 双酶切线性化处理，并利用同源重组试剂盒（）将线性化载体 与已纯化的插入基因片段 或、进行重组连接，将重组产物化转于 感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的 琼脂板上 过夜培养，具体操作流程参考 说明书。重组质粒的 及酶切鉴定挑取白色单克隆菌落 进行初步鉴定，阳性转化子转接于 液体培养基中，碱裂解法提取质粒后分别用、与 进行酶切鉴定，并由江苏金唯智生物有限公司完成重组质粒测序鉴定。对应的重组质粒分别命名为 与 。重组质粒的诱导表达及 检测将测序正确的重组质粒 、及空载体 分别转化入宿主菌 （）中。挑取正
8、确单克隆菌落，分别接种于 含 的 培养基中，培养 。取菌液 转接含 的 培养基中，扩大培养 。加入 ，诱导培养 。取 发酵液，离心，分别收集菌体（无菌水使菌体悬浮）与上清，再加入等比例 上样缓冲液，混匀后沸水煮沸 ，离心，取上清用于 检测酶的表达情况。纳豆激酶的酶活力测定将发酵液 ，离心后收集上清及菌体超声波破碎的上清液，分别用于测定 酶活力，具有操作流程参考 等人已报道的酪蛋白消化法，并稍加改进，具体的操作步骤详见表。标准曲线制作过程中，取含有、标准酪氨酸溶液代替粗酶液与 酪蛋白溶液，其他反应操作不变。然后在 处测定吸光值，并以该吸光值为纵坐标，以酪氨酸含量（）为横坐标绘制标准曲线，通过标准
9、曲线即酶活定义计算酶活力。第 卷第 期 叶延欣，等：大肠杆菌分泌表达纳豆激酶及体外溶栓特性分析表 酪蛋白消化法测定 酶活力测定步骤溶液名称体积 条件 酶液酪蛋白溶液 水浴 三氯乙酸 离心 ，取上清即得酶反应液酶反应液 碳酸钠溶液 酚试剂 水浴 显色，处测定吸光值 酶活定义：下，酶解反应生成 酪氨酸所需的 量为一个酶活单位，单位为 。纳豆激酶的体外溶栓效果取适量的新鲜鸡血于玻璃平皿中静置凝固后，将其切割成大小均匀、质量相近的血凝块（体积约 ），吸干多余水分后称质量（）约 ，分别置于试管中。另取胞外分泌的粗酶液，加入试管内（酶活力分别为 与 ），并以灭活的酶液为对照组，每组设置 个平行，在 恒温下
10、水浴，分别在 后将血凝块取出，吸干多余水分后称质量（）。血凝块的溶解率计算公式为：溶解率 （）（）式中：为溶解前血块质量，；为溶解后血块质量，。结果与分析 、与 基因的克隆以 基因组为模板，成功地扩增得到约 （基因 端含与载体 同源序列）的 基因，结果见图。如图 所示，以基因合成的基因 与 为模板，分别扩增到约 的基因 与（基因 端分别含有与载体 同源序列），这表明成功地扩增了引导分泌功能肽编码基因 与。、与 基因的 产物经测序无误后进行 纯化与回收。：图 基因 的 扩增结果：图 基因 与 的 扩增结果 重组表达载体 与 的酶切鉴定采用同源重组的方法，分别依次将、与 或、与 进行重组连接，并转
11、化于 感受态细胞中，构建 与 重组表达质粒。通过酶切位点分析可知，基因含有 酶切的基因序列，故重组质粒 与 分别用、与 进行酶切鉴定，酶切产物经 琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 所示，河南城建学院学报 年 月重组质粒分别被酶切成与预期大小一致的两条片段，表明重组表达载体 与 分别被成功构建。转化子的 鉴定将重组质粒 、及空载体 分别转化入宿主菌 （）后，以随机挑取转化子的单菌落为模板，利用表 中的引物对 与 进行菌落 验证。如图 所示，随机挑取的 株转化子经 扩增均可得到大小约 单一条带。而以空载质粒转化的转化子菌悬液为模板，未扩增到目的基因条带为图 中 泳道，说明两个重组质粒已分别成功转化于宿主
12、菌 （）中。：；：空载载体 的 酶切；：的 酶切；：空载载体 的 与 酶切；：的 与 酶切。图 质粒 或 酶切鉴定：；：转化子（含质粒 ）筛选鉴定结果；：转化子（含质粒 ）筛选鉴定结果；：空载载体对照。图 重组子的筛选鉴定结果 重组纳豆激酶胞外分泌表达的检测通过酪蛋白消化法对胞内与胞外的粗酶液进行 酶活力的测定分析，结果如图 所示。图 胞外或胞内重组 酶活力测定 ：；：重组蛋白 的胞内表达分析；，：内含空载载体 对照；：重组蛋白 的胞内表达分析；：重组蛋白 的胞外表达分析；：重组蛋白 的胞外表达分析图 检测胞外或胞内重组酶 表达 重组酶 与 的胞内酶活力分别为（）和（），表明借助已报道的引导蛋
13、白分泌功能肽，成功实现了重组酶 与 的生物活性表达，且二者都未形成包涵体，胞外分泌的重组酶仅 检测到 酶活力为（），这优于已报道的 在大肠杆菌中形成重组 的包涵体，失去酶催化活性。且重组酶 的产酶能力高于已报道的产纳豆激酶菌株 （）与 （），为进一步的 生产与深入研究奠定了基础。同时，检测结果表明重组菌株 （含重组载体 ）仅在细胞内成功地表达重组酶 ，在 处有一条目的条带，与预期的理论分子量大小一致，但未能有效 第 卷第 期 叶延欣，等：大肠杆菌分泌表达纳豆激酶及体外溶栓特性分析地分泌于胞外（见图，与 泳道），这与未检测到胞外 酶活力结果相符。而重组菌株 （含重组载体 ）在发酵液上清中（见图，
14、泳道）及细胞内（见图，泳道）都检测到重组目标蛋白，但大部分重组酶仍然存在于胞内，酶活力也较低，可能是酶蛋白与 肽融合后影响了 前导肽帮助 正确折叠成有活性的构象，从而影响了重组酶的催化活性。此外，重组酶 无论是胞内还是胞外，其表达量远高于重组酶 ，表明了 有助于引导 分泌于大肠杆菌胞外，克服了 在 （）宿主内表达的产物易形成包涵体，很难使其体外复性的缺点，可以生产可溶性酶活性蛋白。虽然采用载体蛋白进行融合蛋白的分泌表达是当前融合蛋白分泌表达最常用的策略之一，但融合蛋白的外膜分泌孔道是未知的，且融合载体蛋白的选择对于目的蛋白的分泌量有决定性的影响，不是每一个载体蛋白都能够适用于所有异源蛋白的分泌
15、表达。这也表明 比 更有效地辅助 在大肠杆菌中分泌表达至胞外。因此，下一步尝试构建可酸切的方法删除引导蛋白分泌功能肽，进一步探究功能肽 对 胞外分泌表达与活性的影响，以期有效地提高 胞外分泌产量及催化活性。重组纳豆激酶的体外溶栓作用：重组纳豆激酶添加量为 ；：重组纳豆激酶添加量为 ；：灭活的酶液图 重组酶 对鸡血块溶解效果分析不同酶活力的重组酶 在 时对鸡血凝块的溶解效果见图。如图 所示，灭活的酶液在反应 后，试管内混合液颜色未发生明显的变化，较澄清，凝血块未能得到溶解。在相同时间内，重组酶 的溶解效果随酶活力增加而增高，且与对照组相比均有显著差异（）。当 添加量为 （图 ）时，试管颜色呈粉红
16、色，该酶对鸡血凝块溶解率比对照组高（）。随着重组酶 酶活力增加到 （图 ）时，增强了其对血凝块的溶解作用，试管颜色呈红褐色，凝血块溶解率为（），这与已报道的在 宿主中表达的重组酶溶血凝块效果比较接近，表明了该重组酶具有较好的溶栓作用。结论本文采用基因工程的手段，借助于已报道的引导蛋白分泌功能肽 与，设计出一种新型的 分泌表达方式。通过同源重组技术一步构建重组表达载体 或 ，分别转化于 （）中，经诱导表达后，重组酶 或 都具有酶催化活性，未形成包涵体，弥补了大肠杆菌易形成包涵体的缺陷，且实现了重组酶 胞外分泌表达，胞外的酶活力为（）。且粗酶液 对鸡血凝块体具有良好的体外溶栓作用，也为进一步探究功能肽 对 胞外分泌表达与活性的影响及应用奠定了基础。参考文献 ，：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，：，：（下转第 页）河南城建学院学报 年 月 卢可可，谭玉荣，吴素蕊，等 不同产地尖顶羊肚菌多酚组成及抗氧化活性研究 食品科学，（）：李小林，陈诚，黄羽佳，等 顶空固相微萃取 气质联用分析 种野生食用菌干品的挥发性香气成分 食品与发酵工业，（）：李小林，陈诚，清源，等 会东县不同品种块菌挥发性香