1、器材与试剂 干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等具体步骤1. 水： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)： 主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH调PH到7.4。移入溶液
2、瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 3. 胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑
3、制剂终止胰酶对细胞的作用。 称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4内过夜。 用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20保存以备使用。 4. 0.05胰蛋白酶0.02%EDTA溶液称取胰蛋白酶粉末（1：250） 0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于20保存。5. 青、链霉素溶液： 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。 具体操作
4、均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。 分装于20保存。使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。6. RPMI1640： 溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。
5、安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4冰箱内待用。 使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4时两周有效）。 7. 血清的灭活： 细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。 8. HEPES溶液： HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid
6、 ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。 1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下： 准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后4保存。 注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可
7、。 9. 谷氨酰胺： 合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4下放置1周可分解50，故应单独配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。 一般培养液中谷氨酰胺的含量为14mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶
8、，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 10. 肝素溶液的配制： 含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为? 。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。 11. 型胶原酶： 0.1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20保存。 12. 明胶溶液： 因为明胶难于过
9、滤，所以配制0.1明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌操作分装入50ml小瓶中，4保存。 13. Hanks液： 称取KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4.H2O0.06g，加H2O至 1000ml 注：Hanks液可以高压灭菌。分装于4下保存。14. D-hanks液：1液：NaCL:8.00g/L，KCL : 0.04g
10、/L，Na2HPO4.2H2O:0.06g/L，KH2PO4:0.06g/L，配500毫升；2液：NaHCO3：0.35g/L，配100毫升；3液：酚红：0.02g，用数滴NaHCO3溶解酚红将2，3液移入1液中。定容到1000毫升 PH值是7.4左右。分装于4下保存。15. Giemsa染液： 称Giemsa粉末0.5克，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml）。56中保温90120分钟。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。 使用时按要求用PBS稀释。一般稀释10倍。器材与试剂 干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅
11、拌器等具体步骤1. 水： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)： 主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH调PH到7.4。移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒2
12、0分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 3. 胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25，用电子天平准确称取粉
13、剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4内过夜。 用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20保存以备使用。 4. 0.05胰蛋白酶0.02%EDTA溶液称取胰蛋白酶粉末（1：250） 0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于20保存。5. 青、链霉素溶液： 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位
14、/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。 分装于20保存。使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。6. RPMI1640： 溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。 安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支
15、架腿分别用布包好待消毒。 抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4冰箱内待用。 使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4时两周有效）。 7. 血清的灭活： 细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。 8. HEPES溶液： HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为1
16、0-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。 1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下： 准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后4保存。 注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。 9. 谷氨酰胺： 合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺
17、合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4下放置1周可分解50，故应单独配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。 一般培养液中谷氨酰胺的含量为14mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 10. 肝素溶液的配制
18、： 含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为? 。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。 11. 型胶原酶： 0.1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20保存。 12. 明胶溶液： 因为明胶难于过滤，所以配制0.1明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的
19、问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌操作分装入50ml小瓶中，4保存。 13. Hanks液： 称取KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4.H2O0.06g，加H2O至 1000ml 注：Hanks液可以高压灭菌。分装于4下保存。14. D-hanks液：1液：NaCL:8.00g/L，KCL : 0.04g/L，Na2HPO4.2H2O:0.06g/L，KH2PO4:0.06g/L，配500毫升；2液：NaHCO3：0.35g/L，配100毫升；3液：酚红：0.02g，用数滴NaHCO3溶解酚红将2，3液移入1液中。定容到1000毫升 PH值是7.4左右。分装于4下保存。15. Giemsa染液： 称Giemsa粉末0.5克，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml）。56中保温90120分钟。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。 使用时按要求用PBS稀释。一般稀释10倍。