1、实验l六微生物的生理生化反应,实验内容,大分子物质的水解试验淀粉水解试验糖发酵试验乳糖发酵IMViC试验吲哚试验甲基红试验伏-普试验柠檬酸盐试验,一、大分子物质的水解试验,目的要求证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统；掌握进行生物大分子水解试验的原理和方法。基本原理大分子物质淀粉、蛋白质和脂肪必须通过胞外酶水解成较小的化合物后，才能被微生物吸收利用。,实验器材菌种枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，变形杆菌培养基固体淀粉培养基溶液或试剂卢戈氏碘液仪器或其他用具无菌平板，接种针,淀粉水解试验,大肠杆菌,变形杆菌,枯草芽孢杆菌,37 均倒 匀置 铺培 满养 平24h
2、 板滴入少量碘液，,菌苔周围出现无色透明圈：说明淀粉已被水解，阳性；透明圈大小表明胞外淀粉酶活力的高低。,实验结果,记录实验结果：“+”表示阳性；“-”表示阴性。,思考题,你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？,二、糖发酵试验,目的要求了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用；掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。基本原理糖类是绝大多数细菌的碳源和能源，但是，不同种细菌对不同糖的分解性能和产物并不一致。有些细菌能分解某种糖产酸和产气，有些细菌只产酸不产气，有些细菌则不能分解。,实验器材菌种大肠杆菌，普通变形杆菌培养基乳糖发酵培养基试管3支（内装有倒置的德汉
3、氏小管）仪器或其他用具试管架，接种环,操作步骤,取乳糖发酵培养基试管各3支分别接种普通变形杆菌、大肠杆菌第3支不接种（对照，全班一支）,3支试管37培养24-48h,观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡产生,产酸：溴甲酚紫指示剂由紫色（pH6.8）黄色（pH5.2）,糖发酵试验左侧阳性结果右侧阴性结果,实验结果,记录实验结果：“+”表示产酸或产气；“-”表示不产酸或不产气。,思考题,假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？,三、IMViC试验,目的要求了解IMViC反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。实验器材菌种大肠杆菌，产气肠杆菌培养基蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白
4、胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基溶液或试剂甲基红指示剂，40%KOH，5%-萘酚，乙醚，吲哚试剂等。,1、吲哚试验,基本原理检测细菌代谢色氨酸产生吲哚的能力。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸；吲哚和对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。,操作步骤,分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于蛋白胨水培养基,37培养2d,加6-7滴（0.5ml）乙醚，充分摇动，静置1-3min；,乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚试剂,若在乙醚和培养物之间产生红色环状物阳性反应,2、甲基红（M.R）试验,基本原理检测细菌是否能分解葡萄糖产酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基中
5、的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2）。,操作步骤,分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于葡萄糖蛋白胨水培养基,37培养2d,加入甲基红指示剂2滴,培养基变为红色阳性；培养基变为黄色阴性,3、伏-普（V.P）试验,基本原理测定细菌发酵葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合、脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇；乙酰甲基甲醇在碱性条件下被氧化为二乙酰；二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即为VP试验阳性。,操作步骤,分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于葡萄糖蛋白胨水培养基,37培养2d,加入5-10滴40%KOH，再加入
6、等量的5%-萘酚，用力振荡,置于37温箱中保温15-30min,若培养物呈红色伏-普反应阳性,4、柠檬酸盐试验,基本原理检测细菌利用柠檬酸盐的能力。有些细菌可利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；而有些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基由绿色变为深蓝色。,操作步骤,分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于柠檬酸盐斜面培养基,37培养2d,观察斜面培养基上有无细菌生长和变色,培养基变为蓝色阳性；培养基变为绿色阴性,实验结果,记录实验结果：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。,思考题,讨论IMViC试验在医学检验上的意义。解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏-普试验最初底物与最终产物有何异同处？为什么会出现不同？,