1、1,第四章,生产菌种的扩大培养与保藏,2,生产菌种扩大培养与保藏,3,本章讲述的内容,第一节 种子的制备过程第二节 种子质量的控制第三节 实例第四节 生产发酵罐的无菌接种第五节 菌种的保藏与复壮,发酵工业生产水平的三个决定要素,生产菌种的性能发酵和提取工艺条件生产设备,获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节。,第一节 种子的制备过程,一、菌种概述,(一)生产用菌种的要求,能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；生长速度和产物生成速度较快，发酵周期较短；培养条件易于控制；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；,菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不
2、是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。,7,(二)种子扩培,种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,种子扩培的目的,提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种；目的是：a、缩短发酵周期，降低能耗，提高设备利
3、用率 b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑制杂菌的生长。,菌种的驯化：让菌种从固试管、液体试管，逐步适应；,菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐”现象（稳打稳扎，步步为营）。,9,作为种子的准则(注意菌种与种子区别),菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；生理性状稳定；无杂菌污染；保持稳定的生产能力。,10,种子制备的过程大致可分为：实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段,11,二、实验室种子的制备,1、培养物选择的原则,目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：,对于不产孢子和芽孢的微
4、生物 获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。,获得一定数量和质量的孢子,对于产孢子的微生物,（一）概述,2、培养基选择的原则,培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。,在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。,3、起始接种物的传代问题,细菌,保藏斜面 活化斜面,产孢子,保藏 母斜面 子斜面,目的：使菌种的传代次数尽可能的少。,实验室种子的制备一般采用两种方式对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢
5、子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。,14,15,（二）孢子的制备,1，细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37C。细菌菌体培养时间一般为12天，产芽孢的细菌培养则需要510天。,16,2，霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为2528C。培养时间一般为414天。,17,3，放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28C。培养时间为514天。,4，酵母种子的制备过程一般采用麦
6、芽汁琼脂培养基培养的温度一般为2830C培养时间一般为12天,18,为了提高孢子的萌发率，有时需采取一些特殊措施，如：丙酮丁醇梭菌的孢子在沸水中处理90秒后在放入液体培养基底部，可获得较高的发芽率。有的孢子不被水浸润，浮在液体培养基表面或贴在培养容器内壁，不形成悬液。可在培养基中加入少量无毒的表面活性剂，帮助形成悬液。,20,（二）液体种子制备,1，好氧培养：对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S.griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S.Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子
7、。试管三角瓶摇床种子罐,21,2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）试管三角瓶卡式罐种子罐,22,三、生产车间种子制备,实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。,1、培养物的选择原则,在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。,缩短发酵时间,有利于获得好的发酵结果,菌丝体比孢子要有利：,2、培养基选择的原则,目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于
8、孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。,在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本 二是驯化,例：柠檬酸发酵,以蔗糖为原料,成分 斜面 种子罐 发酵麦芽汁 麦汁 蔗糖 2.5-5%20%NH4NO3 0.225%0.11%K2HPO4 0.03%MgSO4.H2O 0.025%0.025%KCl 0.015%琼脂 2%,薯干粉,成分 斜面 种子罐 发酵麦芽汁 麦汁 薯干粉 10%22-28%(NH4)2SO4 0.5%琼脂 2%,27,3，种子罐的作用：主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，
9、以利于产物的合成。,28,4，种子罐级数的确定 种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积 级数大，则难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。,29,种子罐的种子培养,孢子或摇瓶菌丝,一级种子罐,二级发酵发酵罐,二级种子罐,三级发酵发酵罐,四级发酵发酵罐,三级种子罐,种子罐级数的确定：1.孢子繁殖能力2.发酵罐的体积,种子进入发酵罐：能迅速生长，达到一定的量，利于产物合成。,30,细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27C,4
10、0小时孢子发芽，产生菌丝）二级种子罐（27C,1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌和放线菌快，通常用一级种子,31,确定种子罐级数需注意的问题种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。,5，接种量的确定,移入种子的体积接种量 接种后培养液的体积,除了始于斜面培养的初次接种外，发酵过程的各阶段接种量一般均需0.5
11、10%的接种量，过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%，而由棒状杆菌生产谷氨酸接种量只需1%。,33,种子罐1 发酵罐1 发酵罐2种子罐21）单种2）双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。3）倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于 发酵罐。,34,第二节 种子质量的控制,一、影响孢子质量的因素及控制培养基培养条件培养时间和冷藏时间,35,1，培养基,生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响
12、也不同。原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。,36,水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。,37,措施培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用严格控制灭菌后培养基的质量供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源,38,2，培养条件,（1）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于3
13、7C培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。,39,（2）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。从表中看出相对湿度在40%45%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。,不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响,40,3，培
14、养时间和冷藏时间,（1）培养时间一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。,41,（2）冷藏时间冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4C冰箱保存，发现冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。,42,二、影响液体种子质量的因素
15、及控制,孢子的质量培养基培养条件种龄接种量,43,1，培养基营养成分适合种子培养的需要选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高营养成分要尽可能与发酵培养基相近,44,2，培养条件（1）温度（2）通气与搅拌 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液大量涌
16、泡，液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗。丝状微生物不宜剧烈搅拌。,(3)pH,选择最适种子培养pH的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量培养最后一级种子的培养基的pH应接近于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环境,46,3，种龄种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小
17、时最好。,47,4，接种量接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，并可减少杂菌的生长机会。但接种量会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，有时2025%,48,三、种子质量的控制措施,种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。菌种稳定性的检查，测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并及时对退化菌种进行复壮（内因）提供适宜的生长环境（外因）无（杂菌）检查,种子液生化分析项目主要有：营养基质的消耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等,49,四、种子质量标准,1，细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。,50,