1、细胞培养技术,南方医科大学细胞生物学教研室 罗深秋 Department of Cell Biology,Southern Medical University,第一章 概述,一.细胞培养技术的概念,简史,在体外对细胞培养并进行研究的技术,也叫细胞克隆技术.细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。,细胞全能性细胞培养是基于细胞全能性发展起来的细胞生物学技术克隆：无性繁殖植物细胞培养-转基因植物动物细胞培养-转基因动物,转基因植物,将外源目的基因转入植物的细胞、组织、器官中，获得更能满足人民生活的需要的植物。,细胞、组织、器官,外源目的基因,克 隆,根、茎、叶、花、果实、种子、植株,扦插,
2、生根,发芽,成为植株,培养,植物克隆丰富了人民的生活,植物克隆丰富了人民的生活,抗蚜虫小麦,抗旱耐盐碱水稻；富含铁的水稻；富含胡萝卜素水稻,抗除草剂作物,转基因棉花：动物角蛋白(免、羊毛)棉花，光泽好，手感好，保暖性增强。既 保留了传统棉花的天然本质，又具有了免、羊毛的某些品质；彩色棉花棕、绿、黄、浅蓝、粉红、浅褐等；抗虫棉转基因大豆,更富营养、耐贮藏番茄；不含尼古丁烟叶、能产生药物的食品,细胞培养技术主要包括二大方面内容:1.微生物细胞培养技术 2.动,植物细胞培养技术 1)器官培养技术 2)组织培养技术 3)细胞培养技术,发展简史,二.细胞培养的优点,1.得到的是活细胞：能长时间、直接观察
3、、研究 活细胞的形态、结构、生命活动,2.可控制：可控制-选择对象：类型：上皮？间质？性质：正常？肿瘤？可控制-调节条件：各种因素:物理、化学、生物等因素,可控制-利用方法,采用各种研究技术、记录方法：研究：倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦 显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记-记录：摄影照片、缩时电影、电视-,3.应用广,学科多：对象广：各种动物：低等动物-高等动物-人类 一种动物：不同年龄 不同组织:正常或异常（肿瘤）,4.较经济：,花钱较少但可得到大量、同时、重复性好的生物学性状相似的实验对象,5.不易污染环境,三.细胞培养的缺点,1.现人工无法完全模拟
4、体内环境a.失去彼邻关系 b.失去神经体液的调节和细胞相互间的影响,2.细胞趋向单一化 3.失去原有组织结构和细胞形态4.分化减弱或不显要正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体。,5.某些类型细胞还很难培养6.大规模培养难度大,四.体外细胞培养的方式,粘附型培养:附着在某一固相支持物表面才 能生长的细胞。粘附是大多数有机体细胞在体内外生存和生长发育的基本存在方式,2.悬浮型培养:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。,来源:来自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞.癌肿细胞也可以.特点:在悬浮中生长良好,细胞圆形，单个或小细胞团,优点:生存空间大，提供数量大,传代方便(
5、不需消化),易于收获可获得稳定状态.缺点:观察不方便,很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞),五.体外培养细胞的生长形态分类,根据形态大致的不同，主要2类：上皮样 成纤维细胞样 其它，不定型,1.上皮样细胞型,来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤,形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核,易相连成片相靠紧密相连成薄层铺石状,2.成纤维细胞样细胞,培养中形态与成纤维细胞类似来源：中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮,形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出23个长短不
6、等的突起 中有卵圆形核,成纤维样细胞,六.常用术语,1.细胞系（cell line）：原代培养物首次传代后，就可以称细胞系。不能或有限传代下去称有限细胞系。能连续传代的称连续细胞系。2.细胞株：某类细胞经传代克隆并保持了该类细胞理化特征的细胞群体。3.原代培养：直接取自生物体的组织细胞并进行培养。,4.传代培养：将细胞从一个培养物内分散到另一个培养物的过程。5.转染（transfection）：将某个基因转移到培养细胞核内。6.lipofection：常用细胞转染剂（脂质体），它搭载基因（DNA）后形成复合物可转染到动物细胞。,第二章 细胞培养的条件及设备,一、细胞培养室,二、常用设备1.超净
7、工作台；2.纯水装置；3.抽气泵；4.消毒装置；,5.干燥装置；6.CO2培养箱(孵箱)；7.液氮生物容器；8.冰箱；,9.离心机10.天平11.显微镜12.过滤装置13.空调14.酸度计15.干燥器,三、常用消耗器材1.培养瓶及各种相关玻璃用品、塑料用品和棉制品2.手术器材,四、培养用液1.天然培养基（液）：血清、鸡胚浸出液、鼠尾胶2.人工合成培养液：合成培养基、平衡盐溶液、缓冲液、蒸馏水、消化液和抗菌素等,五、消耗性器皿的清洗、包装及消毒,第三章 细胞培养基本技术,一、原代培养基本技术 取材漂洗剪切消化计数接种二、传代培养技术 去旧换新液消化分装三、细胞冻存及复苏技术,第四章 每代细胞基本
8、的生长过程,一.游离期二.贴壁期三.潜伏期四.指数增长期,游离期细胞接种后最初一段时间,细胞在培养基中呈悬浮状,胞体圆形.,二.贴壁期细胞附着于支持物上,影响因素 1.细胞种类(附着最强)巨噬细胞(30)一成纤维 细胞上皮细胞血细胞(最弱)2.生物因素 血清、培养液中的促附着因子,3.机械，物理等 离心：促进附着 流动：培养液流动可阻止细胞附着 低温：可抑制附着,增加细胞粘附的措施（因素）1.增加支持物粘附性赖氨酸类血清某些生物活性物质,纤维性物质,d.减少接种时细胞悬液的量待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液e.减少培养液中血清的含量 使培养液黏度降低,f.培养液中离子成分及其浓度 如，
9、培养液中的Ca含量过低时不利于 细胞的粘附、贴壁和铺展g.培养液的温度低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁,伸展过程细胞悬浮在培养液中时，近似球体形状 当接触坚硬平面 即铺展于底物上，扁平状 与底物形成很多接触点,伸展分几个阶段(1)开始阶段 开始附着铺开 细胞附着于底物 球形的细胞，下方表面与底物接触成扁 但尚未形成新的伪足,(2)放射状铺展阶段在球形细胞体的周围形成很多伪足隆起伪足形状 主要 柱形丝状:直径0.2-0.5um 长10-20 扁平片状:厚0.1-0.5 宽2-5 尚有:小泡状叶状:直径1-2 开始时:絲状多 以后 片状增加,许多伪足 形成薄的胞质小片牢固贴于底物 胞体中央部分
10、 扁 整亇细胞扁平(3)极化阶段,细胞最后伸展附着的情况 实验：用多种细胞，以显微操作及缩时电影 定位细胞附着于玻璃和聚苯乙烯情况 检测-显微针头 结果：附着规律,附着点：附着规律几乎未见于细胞的中央区(如不在核之下)总在边缘，边缘”摆动”活动的部位 凸的边缘 在薄的边缘 附着区：约为细胞下面表面的15-35,附着、伸展的条件底物 细胞能在很多固体表面附着 最终铺展的程度，取决于底物的性质影响因素：活性物质(贴附、伸展因子):血清、培养液中，或细胞分泌的生物活性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展 细胞借助这些分子,可附着于各种”非特异性”的底物上 如Fn，胶原，聚赖氨酸 机械，物理因素,三.潜伏期细胞活着但无分裂.细胞株624h原代2496h,四.指数(对数)增长期细胞增殖旺盛,数量成倍增多,最适合实验研究.35d以后来到.,判断方法:a.细胞群体倍增时间B.细胞分裂指数,五.停止期(衰退期)细胞长满瓶壁,有活力,不增殖,能存活一段时间.如传代进入下一循环.,传代培养到一定的代数时，细胞的生命活动明显减弱。即使及时传代也无效表明培养物已经进入衰退期，再向前发展，只有退化、死亡,