1、中 国 医 学 科 学 院 学 报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE80February，2023基金项目:中央高水平医院临床科研业务费(BJ-2021-196);第一、二位作者对本文贡献一致技术与方法单细胞转录组测序在多发性大动脉炎肾动脉病变中的初步探索高擎1，吴志远2，李海洋1，李拥军21首都医科大学附属北京安贞医院心血管外科，北京 1000292北京医院血管外科，北京 100730通信作者:李拥军电话:010-85132266，电子邮件:摘要:目的探索单细胞转录组测序(scNA-seq)在多发性大动脉炎(TA)肾动脉病变中的初步应用。方法纳入 2 例北京医院
2、血管外科进行肾动脉手术搭桥治疗的 TA 患者，将其肾动脉组织样本分别采用 GEXSCOPE 试剂盒和自配消化液 2 种酶解方式，并进行 scNA-seq 和生物信息学分析。结果共获取 2920 个细胞纳入下游分析。经过无偏聚类分析后，确定 2 种内皮细胞、2 种平滑肌细胞、1 种成纤维细胞、2 种单核巨噬细胞、1 种 T 细胞及 1 种未定义的细胞。其中，2 种平滑肌细胞主要表现为收缩型及分泌型。scNA-seq 分析结果显示试剂盒酶解法获取的细胞以内皮细胞(57.46%)为主，免疫细胞(13.21%)较少，而自配消化液酶解法获取的细胞以免疫细胞(34.64%)为主。结论scNA-seq 可用
3、于区分 TA 患者病变血管的细胞异质性，不同酶解方式会影响获取细胞的种类与数量。关键词:大动脉炎;单细胞测序;细胞异质性;内皮细胞;平滑肌细胞中图分类号:654.3文献标志码:A文章编号:1000-503X(2023)01-0080-08DOI:10.3881/j.issn.1000-503X.15006Preliminary esults of Single-cell Transcriptome Sequencing inenal Arterial Lesions of Takayasu ArteritisGAO Qing1，WU Zhiyuan2，LI Haiyang，LI Yongjun
4、21Department of Cardiovascular Surgery，Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University，Beijing 100029，China2Department of Vascular Surgery，Beijing Hospital，Beijing 100730，ChinaCorresponding author:LI YongjunTel:010-85132266，E-mail:ABSTACT:ObjectiveTo explore the preliminary application of single-
5、cell NA sequencing(scNA-seq)in the renal arterial lesions in Takayasu arteritis(TA)patients.MethodsThis study included 2 TA patientswith renal artery stenosis treated by bypass surgery in the Department of Vascular Surgery，Beijing Hospital.Theobtained 2 renal artery samples were digested with two di
6、fferent protocols(GEXSCOPE kit and self-made diges-tion liquid)before scNA-seq and bioinformatics analysis.esultsA total of 2920 cells were obtained for fur-ther analysis.After unbiased cluster analysis，2 endothelial cell subsets，2 smooth muscle cell subsets，1 fibro-blast subset，2 mononuclear macrop
7、hage subsets，1 T cell subset，and 1 undefined cell subset were identi-fied.Among them，the two subsets of smooth muscle cells were contractile and secretory，respectively.The resultsof scNA-seq indicated that enzymatic hydrolysis with GEXSCOPE kit produced a large number of endothelialcells(57.46%)and
8、a small number of immune cells(13.21%).However，immune cells(34.64%)weredominant in the cells obtained by enzymatic hydrolysis with self-made digestive liquid.ConclusionscNA-seq单细胞转录组测序在多发性大动脉炎肾动脉病变中的初步探索Vol.45 No.181can be employed to explore the cellular heterogeneity of diseased vessels in TA pati
9、ents.Different enzymatic diges-tion protocols may impact the proportion of different cells.Key words:Takayasu arteritis;single-cell NA sequencing;cellular heterogeneity;endothelial cell;smooth muscle cellActa Acad Med Sin，2023，45(1):80-87多发性大动脉炎(Takayasu arteritis，TA)是一种流行于东亚的具有高度特异性的自身免疫性血管炎性疾病，主要累
10、及主动脉及其一级分支1。TA 患者早期几乎无特定的症状或体征，通常以全身性症状为主，常需借助影像学检查发现或诊断，中晚期病变可引起血管狭窄造成严重的器官缺血甚至坏死，导致脑梗死或心肌梗死等2。前期大量研究发现 TA 是一种涉及 CD4+T 细胞、树突样细胞(dendritic cell，DC)、白细胞介素 6(interleukin 6，IL-6)信号通路和巨噬细胞浸润的自身免疫病3-5。未知抗原通过 DC 表面特异性受体激活这一类抗原提呈细胞 6，分泌多种炎症因子，促进CD4+T 细胞分化为Th17 细胞，诱导IL-17、IL-21、IL-22 的产生参与下游的细胞毒性反应 7。然而，由于该
11、病具体发病机制不明，目前多采用免疫抑制剂或生物制剂等药物治疗。单细胞 NA 测序(single-cell NAsequencing，scNA-seq)技术作为一种新的功能强大的高通量测序技术，可通过分析其捕获的单个细胞的转录组，获取更加详细的细胞信息，进而对比不同状态下细胞的异质性 8。scNA-seq 技术在颈动脉斑块 9、腹主动脉瘤 10 等血管外科疾病中已经得到广泛应用。本团队前期采用 scNA-seq 技术初步探索了 TA 患者与健康人群外周血炎症细胞的占比差异，结果发现 TA 患者CD14+单核细胞比例显著增加 11。但是目前关于scNA-seq 技术应用于 TA 血管壁组织的研究报
12、道较少，不同酶解方式获取的细胞种类亦有不同。因此，本研究旨在探索 scNA-seq 在 TA 肾动脉病变中的初步应用，同时为 TA 的后期多样本单细胞研究提供实验基础。对象和方法对象2019 年 10 月至 2020 年 2 月北京医院血管外科收治的 2 例女性 TA 患者。患者的体征、血清学及影像学检查结果均符合1990 年美国风湿病协会关于TA 的诊断标准12。本研究通过北京医院伦理委员会批准(伦理审批编号:2018BJYYEC-030001)，2 例患者均签署知情同意书。酶解方法采用2 种不同的酶解方法处理 TA 患者的肾动脉样本，其中，TAKA-1 样本采用 GEXSCOPE试剂盒(S
13、ingleron Biotechnologies 公司，中国香港)酶解法，TAKA-2 采用本中心配制的纤维蛋白酶+透明质酸酶+DNA 酶的复合消化液(自配消化液)酶解法，相关酶配制方案正在申请专利中。scNA-seq 技术将单细胞悬液加载到微流控芯片上，使用 GEXSCOPE单细胞 NA 文库试剂盒(Sin-gleron Biotechnologies 公司，中国香港)根据 SingleronGEXSCOPE操作说明书构建 scNA-seq 文库。将文库稀释至4 nmol/L，使用 Illumina Novaseq 6000 测序平台进行测序，测序模式为 150 bp 双端测序。数据质量控制
14、、处理和分析采用 studio(Ver-sion 1.4.1717)中的 Seurat 进行单细胞表达矩阵的质量控制、前期处理和数据分析。每个 Seurat 对象都是用在 3 个以上细胞中表达的基因创建的。其他质量控制条件设置为:(1)每个细胞内所包含的 mNA 种类应在 200 至 3000 之间;(2)每个细胞内所包含的粒体基因占全部 mNA 的比值应小于 25%。经过质量控制后，最终获取2920 个细胞。使用 CellCycleScoring 函数计算细胞周期阶段评分。采用 SCTransform 来减少潜在的批次效应或技术变化。主成分分析设置在 120，然后进行无监督的细胞聚类。利用
15、FindAllMarkers 及其默认参数用于获取每个簇中特定的差异表达基因，然后选择代表性标记(具有高 avg_logFC 和调整 P 0.05 的基因)进行簇标记。内皮细胞与血管平滑肌细胞各自不同亚群之间的差异表达基因采用 FindMarkers进行判定，并将调整 P 0.05 的基因用于京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG)通路分析。结果一般情况共纳入2 例行肾动脉重建术的 TA 患者。2 例患者均接受过药物治疗，但病情仍未控制，影像学检查提示肾动脉严重狭窄，故行肾动脉搭桥手术，并留取肾动脉样本。TA 肾动脉组织
16、的 scNA-seq 及无偏聚类分析TA肾动脉组织样本经 scNA-seq 测序后，共有 2920 个细胞用于下游数据分析，其中1476 个细胞来源于 TAKA-中 国 医 学 科 学 院 学 报82February，20231 样本，1444 个细胞来源于 TAKA-2 样本。无偏聚类分析共获取 2 种内皮细胞(endothelial cell，EC)、2种血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)、1 种成纤维细胞、2 种单核巨噬细胞、1 种 T 细胞及 1种未定义的细胞(图 1A)。2 个样本的分布范围基本相同，但不同区域的分布密度不同(图 1B)。EC 的代表性基因为 ACK1、VWF、PECAM1 等(图 1C)。TA 肾动脉组织的 EC 与 VSMC 的细胞异质性根据不同基因在各细胞亚群的表达情况绘制点图，包括EC-1(ADAMTS1、CSF3、STC1)、EC-2(AMP2、IFI27、FABP4)、VSMC-1(C11orf96、SOBS2、MYL9)、VSMC-2(MYH10、FN1、POSTN)、成纤维细胞(CFD、FBLN1