1、文章编号：（）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金（）作者简介：王一成（），男，硕士研究生；侯尚伟，男，教授，通信作者，：胆红素氧化终产物通过巨噬细胞影响炎症反应王一成，唐茂萍，严志强，曹勇，谢亦璘，张东，张曼，袁尧，乔中东，候尚伟（上海交通大学 生命科学技术学院，上海 ；上海交通大学 药学院，上海 ；上海市奉贤区中心医院 中心实验室，上海 ；上海交通大学 上海系统医学研究中心，上海 ；上海交通大学医学院附属同仁医院，上海 ）摘要：胆红素氧化终产物（，）是影响高胆红素血症高胆红素脑脊液疾病发生和发展的重要因子。目前有关 对炎症反应的影响尚不清楚。为了研究 是如何调控炎症反应的，我们以脂多糖（，
2、）作为炎性诱导因子，以 作为干扰因素，观察了 对小鼠巨噬细胞、树突状细胞功能的影响。结果发现 对树突状细胞分泌的肿瘤坏死因子（，）和白介素（，）并没有影响，但可以显著减少巨噬细胞、，等炎性因子的表达。这个影响是通过下调 信号通路实现的。因此，胆红素氧化终产物是通过巨噬细胞而不是树突状细胞影响炎症反应的。关键词：蛛网膜下腔出血；高胆红素血症；胆红素氧化终产物；巨噬细胞；中图分类号：文献标志码：巨噬细胞和树突状细胞介导的炎症反应在肝衰竭、蛛网膜下腔出血等多种疾病中发挥着重要作用。巨噬细胞和树突状细胞属于单核吞噬细胞系统（，）。树突状细胞（，）是固有抗原呈递细胞，产生炎症细胞因子和趋化因子。巨噬细胞
3、是抗原呈递细胞的另一类，分为经典活化 和交替活化 巨噬细胞。巨噬细胞产生促炎细胞因子如白介素（，）、肿瘤坏死因子（，）、招募 的 趋化因子配体（，）、共刺激分子 （参与 细胞启动和刺激）和诱导型一氧化氮合酶（，）。相反，巨噬细胞分泌大量抗炎细胞因子，表达高水平的内吞受体 ，促进炎症的解决和组织修复。红细胞的裂解导致血红素及其分解产物的产生，包括胆绿素、胆红素和胆红素氧化终产物（，）。其中 ，包括 和 两种，是胆红素产生的内源性小化合物，它们具有类似的化学结构。多项临床研究表明，肝功能衰竭患者血清和脑出血患者脑脊液（，）中均存在 ，。实验研究表明，可影响谷胱甘肽氧化还原状态，增强颈动脉和大脑皮层
4、动脉的收缩，。然而，其对炎症反应是否有影响尚不清楚。本研究旨在探讨 对巨噬细胞和树突状细胞炎症反应的影响。材料与方法细胞培养小鼠骨髓源性巨噬细胞（，）在含有 胎牛血清（，）、青霉素链霉素（）和 巨噬细胞集落刺激因子（，）的 培养基中分化（，第 卷第期 年月复 旦 学 报（自然科学版）（）DOI:10.15943/ki.fdxb-jns.20220805.003，美国）。小鼠骨髓源性树突状细胞（，）与 的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（，）和白细胞介素（，）（，美国）在 培养。小鼠巨噬细胞细胞株 取自中国科学院上海细胞生物学研究所，在含 胎牛血清的 培养基中培养。细胞活力测定使用 （）（，日本）评估
5、细胞活力。将细胞接种于 孔（个孔）培养板上，用，、浓度的 处理贴壁细胞。后，每孔板中加入 体积含量的 溶液。孵育后在 波长下读取吸光值。细胞处理巨噬细胞和树突状细胞用 预处理后再用 脂多糖（，）刺激。收集细胞进行 ，和流式细胞术分析。酶联免疫吸附试验（）细胞在 （）刺激前，以指定浓度的 预处理。收集上清液，采用 试剂盒检测 水平，试剂盒购自中国武汉 公司。试剂盒采用典型的夹心法检测目标化合物浓度。其中预包被抗体为鼠源单克隆抗体，检测相抗体为兔源多克隆抗体。使用中，样品，抗体（稀释），抗生物素过氧化物酶复合物（稀释）以及底物的孵育时间分别为 ，。实时定量聚合酶链反应分析（）使用 试剂盒（，）从树
6、突状细胞以及巨噬细胞（和 ）中提取总 ，并用购自 （，日本）的 逆转录为 。随后，在 系统（）上使用从 （）获得的 进行 。过程中采用的退火温度为，延伸时间为 。所用引物采用美国国家生物技术信息中心（）网站上的 设计，由上海森尼生物科技有限公司合成。基因表达以 为内参，用 方法计算各个基因 的相对表达量。引物：用于扩增（，）；用于 扩增（，）；用于 扩增（，）；用于 扩增（，）；用 于 扩 增（，）。分析用强 裂解液裂解细胞。随后，将提取的总蛋白用十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳（）方法进行分离，并将蛋白转移到购买自 （，）的聚偏二氟乙烯（）膜上。膜封闭后与一抗在条件下孵育过夜。磷酸化一抗
7、（），（）和 （）购买自 。一抗 、和 购自 （中国武汉）。（）购自 。膜与辣根过氧化物酶（）结合的山羊抗小鼠兔二抗（）在室温下孵育。使用增强型化学发光（）试剂盒（）检测蛋白条带。流式细胞术分析用 抗体（，）阻断小鼠骨髓源性巨噬细胞（），用抗小鼠 和 （）染色。细胞固定 ，渗透 。细胞内染色采用 （）染色，数据分析采用 软件（）。免疫荧光检测将 孔板上的巨噬细胞用多聚甲醛固定 ，渗透 ，用牛血清白蛋白阻断 后，用抗 抗体（）在下孵育过夜。随后，用磷酸盐缓冲盐水（）洗涤细胞次，并与异硫氰酸荧光素（，）标记的二抗孵育。细胞核用第期王一成等：胆红素氧化终产物通过巨噬细胞影响炎症反应，二脒基苯基吲哚（
8、，）染色。统计分析所有数值均以平均值标准差（）表示。在 （，）中采用检验进行组间差异统计 。表示差异有统计学意义。结果 不影响 中促炎细胞因子的表达 属于 ，其功能是抗原提呈。因此，我们首先评估了 对 的影响。用 （）处理 ，加入或不加入 （）处理。如图所示，或 均未改变促炎细胞因子 和 的 表达。图 对 促炎细胞因子 表达的影响 检测（）和（）表达。所有数值均以个独立实验的平均值 表示。表示与未处理组相比，表示与 单独处理组相比，。抑制巨噬细胞 介导的炎症反应首先，我们通过 实验检测了 对 存活率（）的影响。用不同剂量的 （）处理细胞。如图（）所示，各浓度的 处理后，未观察到细胞毒性效应。如
9、图（）所示，与未处理细胞相比，单独 可以促进巨噬细胞 型标志物 、和 的 表达上升，而 或 可显著抑制这些标志物的 表达。抑制了 激活的 中 和 的表达。此外，或 对 激活的 的 表达均无影响。刺激巨噬细胞合成 及其产物一氧化氮（）。结果显示，与未处理细胞相比，处理诱导 和蛋白表达，而 或 （）显著抑制 和蛋白表达（图（）。与 的表达类似，或 预处理降低了 激活的 的生成（图（）。是巨噬细胞产生的一种重要的促炎因子。如图（）所示，与未处理细胞相比，处理诱导 的产生，而 （）显著抑制 激活的 细胞 的产生。对巨噬细胞分泌的 无影响。和 分别是 和 极化 的表面标记物。结果表明，与未处理组相比，处
10、理后 中 的表达显著增强。或 显著降低了 刺激后 巨噬细胞的数量（图（）。此外，与 处理组相比，显著增加了 巨噬细胞的数量（图（）。抑制 诱导的 细胞炎症反应首先，我们通过 实验检测了 对 细胞活力的影响。用不同剂量的 或 （）处理细胞。图（）（见第 页）显示，特定浓度的 或 处理 细胞后，细胞存活率没有受到明显影响。如图（）（见第 页）所示，（）或 显著降低 诱导的 巨噬细胞中 和 的表达，且呈剂量依赖性。此外，复 旦 学 报（自然科学版）第 卷图 对 中巨噬细胞 极化和向 表型转化的影响 （）法检测 存活率；（）表达；（）表达；（）的表达；（）的代表性 结果；（）表达灰度分析；（）表达；（
11、）细胞培养上清中浓度；（）法测定上清中成熟 的浓度；（）流式细胞术检测细胞表面标志物 和 的表达水平（）。表示与未处理组相比，表示与 单独处理组相比，。对 表达的抑制作用强于 。（）显著降低 诱导的 表达（图（），见第 页）。此外，与未处理的细胞相比，处理则显著上调 的 和蛋白表达（图（），见第 页）。而 或 （）显著抑制 激活的 细胞第期王一成等：胆红素氧化终产物通过巨噬细胞影响炎症反应 的产生。是一种诱导型的环氧合酶亚型，在调节炎症反应中发挥重要作用。我们的结果表明，与未处理细胞相比，处理诱导了 的表达，而 （）抑制了 激活的 细胞中 的表达（图（）。是炎症反应的关键调节因子。用 （）预处
12、理细胞，然后用 （）处理细胞、和 ，观察 不同处理时间下 的分泌情况。与和 组相比，或 ，处理细胞 后，的表达受到抑制作用更加明显（图（）。以 的 预处理细胞，然后用 （）处理细胞，观察不同浓度的 对 表达的抑制作用。如图（）所示，或 显著抑制 （）激活的 细胞分泌，且呈剂量依赖性。此外，处理的细胞中 水平也被 或 抑制（图（）。图 对 诱导的 细胞炎症反应的影响 （）法检测 细胞存活率；（）表达；（）表达；（）的表达；（）的代表性 结果；（）表达灰度分析；（）表达；（）的代表性 结果；（）表达灰度分析；（）处理，上清中 的表达；（）不同浓度 处理后，上清中 的表达；（）的表达。表示与未处理组
13、相比，表示与 单独处理组相比，。复 旦 学 报（自然科学版）第 卷 抑制 激活的 细胞中 和 通路的磷酸化 激活 通路，导致促炎介 质、细 胞因 子 和 炎 症相 关 基 因表达 的上调。我们用 和免疫荧光成像方法分析 通路相关蛋白表达的情况。结果显示，或 显著抑制 诱导的（）磷酸化（图（）。而 或 不影响 （）和 （）的磷酸化。我们同时检测了 对 通路的影响。结果显示，或 处理降低了 刺激后细胞核中 蛋白的表达水平（图（）。此外，恢复了 处理后细胞中 蛋白的表达（图（）。与这些结果一致，从图（）免疫荧光的结果可以看出，无论是未处理的细胞还是 或 处理的细胞，细胞核中几乎没有 的存在。处理后，
14、易位入核。或 预处理显著减少了 诱导的 的核易位（图（）。这些结果提示 能有效抑制 诱导的 活化。图 对 处理 巨噬细胞 和 蛋白水平的影响 （）代表性的 信号通路 结果，、表示磷酸化的、；（）和 的代表性 结果，结果以 和 为内参；（）巨噬细胞中 核易位的代表性免疫荧光图像；比例尺为。表示与未处理组相比，表示与 单独处理组相比，。第期王一成等：胆红素氧化终产物通过巨噬细胞影响炎症反应讨论既往研究发现，血红素及其衍生物对 （包括巨噬细胞和树突状细胞）具有促炎和抗炎作用。然而，对 的影响尚不清楚。我们的研究结果表明，抑制了 诱导的巨噬细胞的炎症反应，但对树突状细胞没有抑制作用。是 诱导巨噬细胞中
15、 产生的重要促炎介质。结果表明，抑制 诱导的小鼠巨噬细胞 的产生和 的表达。、和 是巨噬细胞产生的 型促炎因子。以往的研究表明，这些细胞因子在中枢神经系统细胞系中的表达不受 的影响。相反，我们的结果表明，与未处理的巨噬细胞相比，抑制了种促炎因子的基础表达。此外，抑制了 激活的巨噬细胞中、和 的表达。和 分别是 和 极化巨噬细胞的表面标记物。刺激的巨噬细胞呈现 极化状态，并产生 。我们的结果表明，抑制了 诱导的巨噬细胞 的表达，但诱导了 的表达。是前列腺素（，）产生中的限速酶，能够影响血管高通透性、细胞分化和炎症反应。类阿司匹林药物可以抑制急性炎症，并通过抑制 发挥作用。我们的结果表明，抑制了
16、激活的巨噬细胞中 的表达。另一种 前体胆红素通过抑制 和 激活的和腹膜巨噬细胞中的炎性小体激活来降低 的产生，。我们的研究结果表明，抑制 激活的巨噬细胞产生。刺激导致巨噬细胞中多种炎症通路的激活，如 和 。此外，通过 和 通路抑制炎症反应可改善肝衰竭时的肝损伤或蛛网膜下腔出血时的脑损伤 。是 、和、等炎症细胞因子的关键转录因子。我们的实验结果表明，通过减少 激活的巨噬细胞 核易位和 降解来抑制 通路。信号通路与 通路交叉，在炎症因子的产生中发挥重要作用。在本研究中，我们发现 抑制 激活的巨噬细胞中 的磷酸化，但不影响 和 的磷酸化。先前的研究也证实了这些结果，并表明 信号通路对的产生以及 、和 的表达至关重要。在本研究中，我们在体外评估了 的抗炎作用（图）。此外，先前的研究表明，可以通过激活抗氧化反应（部分通过 途径）来影响肝细胞谷胱甘肽氧化还原状态和氧化应激，。然而，它们对巨噬细胞氧化损伤的影响有待进一步的评估。图 通过抑制 和 通路的激活，抑制了 诱导的巨噬细胞而非树突状细胞的炎症反应 ，复 旦 学 报（自然科学版）第 卷参考文献：，（）：，（），：，（）：，（）：，（）：，（）：