1、2023 年第 2 期分析测试啶虫脒是一种新型广谱杀虫剂，广泛用于水稻、蔬菜、果树的蚜虫、飞虱等的防治。虽然其为低毒杀虫剂，但对人、畜等有毒，而且其广泛的使用，不可避免地造成在农作物中的残留，经由食物链的富集作用进入人体，严重影响人们的身体健康 1。国家对于食品安全越来越重视，不断修订完善食品安全国家标准 2，严格规定食品中农药最大残留限量。但在经济效益的驱使下，啶虫脒的超标使用和滥用造成的残留问题仍然存在，所以加强啶虫脒农药残留的分析检测对于人民群众的身体健康具有重要的意义。啶虫脒的检测方法有很多种，气相色谱法 3、液相色谱串联质谱法 4、化学比色法 5、免疫分析法 6 等，但这些方法普遍存
2、在前处理过程复杂、耗时费力、检测成本高等缺点。近年来，基于适配体电化学传感器检测农药技术得到广泛关注 7,8。电化学传感器能够通过传感膜与待测物分子产生化学信号，再转换成电信号，建立待测物分子浓度与电信号之间的对应关系，实现检测的目的。经过筛选得到的适配体与农药分子能够特异性结合，而且制备方便、易修饰、稳定性好 9。本文通过构建稳定性好、成本低、易操作的电化学适配体传感器，实现了对啶虫脒的高灵敏度、高特异性检测。1实验部分1.1仪器与试剂CHI660E 型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；JY600 型电泳仪（北京君怡东方电泳设备有限公司）；WD-9413B 型凝胶成像仪（北京六一仪器厂）
3、；Milli-Q 型超纯水机（美国密理博公司）。啶虫脒（Ace，乙醇溶液，100g mL-1）、亚甲基蓝（MB，AR）均来自阿拉丁公司；三（羟甲基）氨基甲烷、丙烯酰胺、6-巯基-1-己醇（MCH）均为分析纯，麦克林公司；盐酸三（2-羧乙基）膦（TCEP，AR）、1TE 缓冲液、4S Red plus 核酸染色剂来自生工生物；脱氧核糖核酸（DNA）由生工生物合成，具体序列见表 1；所有溶液均由 Milli-Q 水系统的超纯水制备。电化学适配体传感方法检测啶虫脒*徐子龙，张欣刚，颜丙银，郑向江（临沂大学 化学化工学院，山东 临沂 276000）摘要：建立了一种基于适配体的电化学传感方法检测啶虫脒。
4、适配体能够与啶虫脒特异性结合，由此引发的杂交链式反应可以实现信号放大。该方法能够对啶虫脒实现高灵敏度、高特异性检测。结果表明，在1g mL-10.1ng mL-1范围内，电化学信号与啶虫脒浓度的对数值存在线性关系，检测限低至 0.028ng mL-1。关键词：啶虫脒；适配体；电化学传感中图分类号：O657.1文献标识码：ADetermination of acetamiprid based by electrochemical aptamer sensing method*XU Zi-long,ZHANG Xin-gang,YAN Bing-yin,ZHENG Xiang-jiang（Scho
5、ol of Chemistry&Chemical Engineering,Linyi University,Linyi 276000,China）Abstract:An electrochemical sensing method for determination of acetamiprid based on aptamer was developed.Aptamer can specifically bind to acetamiprid,and the resultant hybridization chain reaction can amplify thesignal.This m
6、ethod can achieve high sensitivity and high specificity for the detection of acetamiprid.The resultsshow that there is a linear relationship between electrochemical signal and log value of acetamiprid concentration inthe range of 1g mL-10.1ng mL-1,and the detection limit is as low as 0.028ng mL-1.Ke
7、y words:acetamiprid;aptamer;electrochemical sensingDOI：10.16247/ki.23-1171/tq.20230217收稿日期：2022-04-17基金项目：临沂大学大学生创新创业训练计划项目支持（No.X202110452036）作者简介：徐子龙（2001-），男，大学本科在读，研究方向：分析检验。通信作者：郑向江（1980-），男，副教授，2019 年毕业于青岛科技大学应用化学专业，博士研究生，主要从事电化学分析检测研究。Sum329 No.2化学工程师ChemicalEngineer2023 年第 2 期2023 年第 2 期1.2实
8、验步骤所有的 DNA 在使用前经离心处理，用 TE 缓冲溶液配置成溶液。HP1 和 HP2 在使用前于 95保持5min 后逐渐冷却至室温，置于-20冰箱备用。金电极在使用前用 0.05m 的 Al2O3抛光，用超纯水冲洗干净，分别在水、乙醇、水中超声3min，用N2吹干，在 0.5M H2SO4中以 50mV s-1，在-0.21.6V扫描至循环伏安曲线图稳定。将 L1 用 TCEP 活化1h 后滴于电极表面，4冰箱过夜。将电极取出用超纯水冲洗，将 1mM MCH 滴于电极表面 1h，封闭多余的位点；滴入过量的适体链，室温下进行反应 1h，再用超纯水冲洗电极表面，除去多余的适体链。再将不同浓
9、度的啶虫脒农药滴于电极表面 1h，冲洗后将HP1、HP2 及 MB 滴于电极表面反应 90min，在 1PBS 中电压-0.60V 进行差分脉冲伏安法（DPV）测量。三电极系统包括：金电极（=3mm）作为工作电极，Ag/AgCl（饱和 KCl）作为参比电极，Pt 丝作为对电极。将 10L 不同的样品与 2L DNA 上样缓冲液（6）混合均匀，转移到丙烯酰胺凝胶中（10%），在1TAE 下，电压为 100 V 下跑胶 1h，然后将凝胶放置在 4S Red plus 核酸染色剂（3）中进行泡染 30min，最后在凝胶成像仪下进行成像分析。2结果与讨论2.1检测原理分析本文构建了基于适配体的电化学传
10、感器来检测啶虫脒。实验原理见图 1。L1 链与啶虫脒适体链（Apt）能够杂交成 DNA双链。首先，利用 L1 链修饰的巯基与金电极反应，将L1 链固定在电极表面。加入过量的适体链（Apt），充分与 L1 链杂交，用超纯水冲走过量的适体链。加入啶虫脒之后，能够与适配体特异性结合，从而将 L1单链暴露出来。继续加入 HP1 和 HP2，L1 单链能够引发两个发夹 DNA 之间的杂交链式反应，延伸成长的双链 DNA 提供了丰富的位点用于亚甲基蓝的吸附。差分脉冲伏安法（DPV）测量产生电化学信号。啶虫脒加入越多，产生的 L1 链就越多，引发更多的杂交链式反应，从而可以得到更高的电化学信号。由此建立起啶
11、虫脒浓度与电化学信号的关系。2.2方法可行性分析通过丙烯酰胺电泳来分析实验的可行性，见图2。条带 1-7 分别为 Marker、L1、Apt、HP1、HP2、L1+Apt、L1+Apt+Ace+HP1+HP2。由图 2 可见，条带 1 到条带 6 均符合预期的结果，条带 7 产生了一个新的条带，并且该条带的位置最高，说明分子量大，在丙烯酰胺凝胶里的迁移率最慢，这表明啶虫脒的存在成功引发了杂交链式反应，生成了双链 DNA。2.3实验条件优化2.3.1反应时间的影响研究了杂交链反应时间对反应的影响，在其他条件为最佳条件情况下对杂交链反应（HCR）的时间进行了优化。根据 HCR 反应为发夹 DNA
12、被逐渐打开从而延伸的性质将反应时间分别设置为 30、60、90、120、150min，结果见图 3。表 1DNA 序列Tab.1DNA sequence名称5-3AptCTGACACCATATTATGAAGAL1TAATAGGTGTTCAGCACCAAATT-（CH2）6-SHHP1AAGGTGCTGACACCATATTATTAAATCCGCTTAATATGGTGHP2ATAATATGGTGCAGCACCTTCACCATATTATAGCGGATTTADNA1适配体DNA啶虫脒发夹DNA1发夹DNA2亚甲基蓝图 1实验方案原理图Fig.1Schematic diagram1234567图 2丙烯
13、酰胺凝胶电泳图Fig.2Acrylamide gel electrophoresis diagram徐子龙等：电化学适配体传感方法检测啶虫脒*182023 年第 2 期由图 3 可见，随着反应时间的逐渐增加电流信号也逐渐增强，说明时间延长，使得杂交链反应的双链长度延伸，更多的电活性物质嵌插在双链 DNA 上获得了更强的电化学信号，当时间增加到 90min 后，继续延长反应时间，峰电流信号不再增加，反而有一些降低，因此，选择 90min 为最佳反应时间。2.3.2发夹 DNA 浓度的影响研究了发夹 DNA 浓度对于反应电信号的影响，对发夹 DNA 的浓度进行了优化。由于杂交链反应中两种发夹 DN
14、A 的量对应关系为1 1，所以将 HP1 与 HP2 的浓度设置为相同，在其他条件为最优条件下探究不同浓度的两种发夹DNA 浓度对反应信号的影响，将发夹 DNA 的浓度由低到高分别设置为 1、1.5、3、5、10M，结果见图4。由图 4 可知，随着浓度的增加，信号峰也在增加，当浓度为 5M 时达到最大值，继续增加浓度，信号峰变化不大，所以选用 5M 为杂交链式反应的最佳浓度。2.4工作曲线在优化条件下，检测了不同浓度的啶虫脒，其DPV 曲线见图 5a 和图 5b。由图 5 可见，随着啶虫脒浓度从0g mL-1增加到 1g mL-1，DPV 峰强度也逐渐上升，并且观察到峰值电流与啶虫脒浓度对数值
15、之间存在良好的线性关系，线性范围从 1g mL-1到 0.1ng mL-1。线性回归方程为 IP（100nA）=6.468+0.613lgC（R2=0.995）。利用 3 法计算，其检测限为 0.028ng mL-1。2.5特异性评估为评估该方法对于啶虫脒检测的特异性，将相同浓度的啶虫脒（A）与其噻虫胺（B）、丙溴磷（C）、吡虫啉（D）和噻虫嗪（E）在相同的实验条件下进行检测对比，结果见图 6。0.400.350.300.250.200.150.100.05-0.4-0.3-0.2-0.10.0电压/V电流/A30min60min90min120min150min图 3不同反应时间的 DPV
16、图Fig.3DPV diagrams of different reaction time0.400.350.300.250.200.150.100.050.0011.53510发夹 DNA浓度/M电流/A图 4发夹 DNA 浓度优化柱状图Fig.4Histogram of optimized DNA concentration of hairpin0.300.250.200.150.100.050.00ABCDE啶虫脒（A）噻虫胺（B）丙溴磷（C）吡虫啉（D）噻虫嗪（E）农药品种电流/A图 6不同农药的特异性检测Fig.6Specificity detection of different pesticides徐子龙等：电化学适配体传感方法检测啶虫脒*图 5a.浓度梯度的 DPV 图；b.DPV 信号与啶虫脒浓度的对数线性相关关系Fig.5a.DPV diagram of the concentration gradient；b.Linear correlation between DPV signal and log valueof acetamiprid concentratio