1、*基金项目:内蒙古自治区自然科学基金资助项目(2019LH08043)通讯作者:庞春艳【基础医学】低氧诱导因子 1对胶原诱导关节炎小鼠相关肺间质病变的治疗作用*康敏，孟金，芦彦蓉，郭煜，庞春艳 包头医学院第一附属医院中心实验室(内蒙古自体免疫学重点实验室)，内蒙古 包头 014010 摘要目的:探讨低氧诱导因子 1(Hypoxia inducible factor 1，HIF 1)的小干扰NA(Small interfering，NA，siNA)对胶原诱导关节炎(Collagen induced arthritis，CIA)小鼠相关肺间质病变(Interstitial lung disease
2、，ILD)的治疗效果及小鼠胸腺细胞中 T 淋巴细胞亚群的影响。方法:建立类风湿关节炎的动物模型 CIA 小鼠，实验分为空白组、CIA 模型组、阴性对照组和 HIF1 siNA 组，空白组小鼠不做任何处理，阴性对照组小鼠尾静脉注射空载体腺病毒，HIF 1 siNA 组小鼠尾静脉注射 HIF 1 siNA 腺病毒，每周 1 次，共 4 周。实验结束后麻醉断颈处死小鼠，流式细胞术检测小鼠胸腺中 Th1 和 Th2、Th17 和 Treg 比例的变化，HE 染色观察小鼠肺组织的病理变化。结果:CIA 模型组和阴性对照组小鼠胸腺细胞中 Th1 细胞和 Th17 细胞的比例升高，Th2 细胞和 Treg
3、的比例下降，与空白组比较具有统计学意义(P 0 05)。HIF 1 siNA 组小鼠胸腺细胞中 Th1 和 Th17 细胞的比例降低，Th2 细胞和 Treg 的比例升高，与 CIA 模型组和阴性对照组小鼠比较，有统计学意义(P 0 05)。模型组小鼠肺组织中出现大量淋巴细胞浸润、肺泡壁被破坏，同时出现肺间质改变，HIF 1 siNA 处理 CIA 小鼠后，小鼠肺组织淋巴细胞浸润情况、肺泡壁破坏程度及肺间质改变均有所减轻。结论:HIF 1 siNA 可以降低胸腺细胞中 Th1 细胞和 Th17 细胞的比例，同时升高 Th2 细胞和 Treg 的比例，并减轻 CIA 小鼠肺组织的淋巴细胞浸润情况
4、，缓减肺泡壁的破坏及肺间质的改变，提示 HIF 1 siNA 可以通过调控胸腺细胞中的 T 淋巴细胞亚群，对 CIA 小鼠引起的肺间质病变起治疗作用。关键词 肺间质病变;低氧诱导因子 1;Th17 细胞;Treg;Th1 细胞;Th2 细胞DOI:10 16833/j cnki jbmc 2023 03 002Therapeutic effect of hypoxia inducible factor 1 on collageninduced arthritis associated interstitial lung diseaseKANG Min，MENG Jin，LU Yanrong，G
5、UO Yu，PANG Chunyan Central laboratory，The first affiliated hospital of Baotou Medical College(Inner Mongolia Key Laboratory of Autoimmunity)Baotou 014010，ChinaABSTACTObjective:To investigate the effect of hypoxia inducible factor 1(HIF 1)on col-lagen induced arthritis(CIA)mice with interstitial lung
6、 disease(ILD)and T lymphocyte subsets inthymocytes by small interfering NA(siNA)vector of HIF 1 Methods:CIA mice were estab-62023 年第 39 卷第 3 期Vol 39No.32023lished and divided into control group，CIA model group，negative control group and HIF 1 siNAgroup The mice in control group were not treated，and
7、the mice in negative control group were injec-ted with empty adenovirus and those of HIF 1 siNA group were injected with HIF 1 siNAadenovirus，once a week for 4 weeks After the experiment，all thymus were collected and thymocyteswere cultured，and the changes of Th1 cells and Th2 cells，Th17 cells and T
8、regs in thymus were detec-ted by flow cytometry，the pathological changes of mice lung tissue were observed by HE staining e-sults:the proportion of Th1 cells and Th17 cells in thymocytes of CIA model group and negative controlgroup increased and the proportion of Th2 cells and Tregs decreased，which
9、was statistically significantcompared with control group(P 0 05)The proportion of Th1 and Th17 cells in thymocytes of micein HIF 1 siNA group decreased，while the proportion of Th2 cells and Treg increased Com-pared with CIA model group and negative control group，the difference was statistically sign
10、ificant(P0 05);There were a lot of lymphocyte infiltration，alveolar wall destruction and lung interstitialchanges in the lungs of mice in CIA model group After HIF 1 siNA treated CIA mice，the lym-phocyte infiltration in the lungs of mice，the destruction of alveolar wall and the changes of lung strom
11、awere alleviated Conclusion:HIF 1 siNA can reduce the ratio of Th1 cells to Th17 cells and in-crease the ratio of Th2 cells and Tregs in thymocytes，reduce the lymphocyte infiltration in the lung tis-sue of CIA mice，and slow down the destruction of alveolar wall and the change of lung stroma，sugges-t
12、ing that HIF 1 siNA can treat CIA mice with interstitial lung disease by regulating T cell subsetsin thymocytesKEY WODSInterstitial lung disease;Hypoxia inducible factor 1;Th17 cells;Tregs;Th1 cells;Th2 cells类风湿关节炎(heumatoid arthritis，A)是一种多系统受累的自身免疫性疾病，常出现关节外的表现，比如血液系统、神经系统、呼吸和消化系统等，其中以肺脏受累最为常见，肺脏受
13、累的 A 患者会出现活动性呼吸困难，X 线胸片呈现弥漫性浸润阴影，严重影响患者的生活质量。A 合并肺间质病变(Interstitial lung disease，ILD)的发病机制尚未完全阐明，许多因素会影响 A ILD 的发病。A ILD 的发病涉及 T 细胞和 B 细胞等众多免疫细胞及细胞因子1、自身抗体2 3、基因突变4、细胞外基质5 及转化生长因子 (Transforming growth factorbeta，TGF )信号转导等6，但这些也不能完全阐释 A ILD 的发生发展，因此探讨 A ILD 的发病机制并寻找新的治疗靶点成为目前的研究热点。课题组前期研究发现低氧诱导因子 1(
14、Hy-poxia inducible factor 1，HIF 1)对胶原诱导关节炎(Collagen induced arthritis，CIA)小鼠有治疗作用，那么它对 A ILD 是否也有同样的治疗作用呢?因此，本研究采用小干扰 NA(Small interferingNA，siNA)沉默 HIF 1 的表达，分析其对 CIA小鼠合并 ILD 的治疗作用及对 CIA 小鼠胸腺细胞中 T 细胞亚群的影响，探讨 HIF 1 作为治疗 A ILD 新靶点的可能。1材料和方法11实验动物50 只 5 周龄的 DBA/1 小鼠，雄性，购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司，体质量约(20 2)g，本
15、实验严格按照动物伦理准则进行。1 2试剂及仪器牛型胶原购自 chondrex 公司，PMA/Ionomycin 和 BFA/Monensin 购自联科生物，抗CD4 抗体、抗 CD25 抗体、抗 IFN 抗体、抗 IL 10抗体、抗 FOXP3 抗体和抗 IL 17 抗体均购自 eBio-science 公司，流式细胞仪购自美国 BD 公司。1 3实验方法1 3 1建立胶原诱导关节炎小鼠模型将牛 II 型胶原与完全弗氏佐剂在冰上混合乳化，于 DBA/1 小72023 年第 39 卷第 3 期Vol 39No.32023鼠尾根部皮下注射上述乳化混合物进行初次免疫。21 d 后进行第二次免疫，28
16、 d 小鼠关节出现红肿，即造模成功。1 3 2HIF 1 siNA 载体的构建和病毒的制备针对 HIF 1 的序列并参考文献设计一段siNA 序列，序列为 5 TGGATAGCGATATGGT-CAAT 3，送到北京合生生物科技有限公司构建载体，同时以序列为 5 TTCTCCGAACGTGTCACGT 3 作为阴性对照，载体构建成功后转染 293T 细胞制备病毒，病毒滴度分别为 5 53 1010PFU/mL 和1 58 1011PFU/mL。13 3HIF 1 干预 CIA 小鼠8 只 DBA/1 小鼠不进行造模处理，称为空白对照组，其余的 32 只DBA/1 小鼠进行造模，24 只造模成功为 CIA 小鼠，随机分成 3 组，分别为:CIA 模型组，造模成功的DBA/1 小鼠;阴性对照组，CIA 小鼠尾静脉注射阴性对照载体;HIF 1 siNA 组，CIA 小鼠尾静脉注射 HIF 1 siNA 载体，每周 1 次，共 4 次。实验结束后，麻醉断颈处死小鼠。13 4小鼠肺组织的病理改变分别取所有组每只小鼠的一块肺组织，PBS 清洗，浸泡在含 4%多聚甲醛的冻存管中，送至武汉赛维尔生物科