1、现代食品现代食品XIANDAISHIPIN188188/分析检测分析检测Analysis and Testingdoi:10.16736/41-1434/ts.2022.24.050等离子体预处理对花生粕蛋白酶解特性的影响Effect of Plasma Pretreatment on Protease Hydrolysis of Peanut Meal 潘 宁，贺俊伟，孙萌辉，陈彬云，苏东民（郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450002）PAN Ning,HE Junwei,SUN Menghui,CHEN Binyun,SU Dongmin(School of Food an
2、d Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China)摘 要：本研究以花生粕为实验原料，通过高效液相色谱仪、扫描电子显微镜等手段，研究不同等离子体预处理对花生粕蛋白的分子量大小、氨基酸组成以及微观结构的影响规律。与对照相比，经过等离子体预处理的花生粕蛋白的水解度提高了 10.69%；高效液相色谱仪和氨基酸分析仪结果表明，经过等离子体预处理后的花生粕蛋白的分子量主要集中在 200 1 000 u，其中 Glu、Arg、Asp、Leu 和 Phe 5 种氨基酸在花生粕蛋白的水解过程中起到了重要作
3、用；通过对处理 120 s 的花生粕蛋白进行酶解动力学参数测定，与对照相比，等离子体预处理组的KA保持基本不变，而KM下降了14.67%；在1 000倍的扫描电镜下发现处理后的花生粕蛋白结构受到破坏。本文系统揭示了等离子体调控过程中底物蛋白关键结构域变化与其酶解特性之间的内在关联机制，为制备高效酶解和结构紧凑的花生粕蛋白提供了理论基础。关键词：等离子体预处理；花生粕蛋白；酶解特性；分子量分布；氨基酸组成Abstract：In this study,peanut meal was used as experimental raw material.By means of high perform
4、ance liquid chromatography(HPLC)and scanning electron microscopy(SEM),the influences of different plasma pretreatment on the molecular weight,amino acid composition and microstructure of peanut meal protein were studied.Compared with the control,the degree of hydrolysis of peanut meal protease hydro
5、lysate after plasma pretreatment was increased by 10.69%.The results of high performance liquid chromatography and amino acid analyzer showed that the molecular weight of the peanut meal protease hydrolysates after plasma pretreatment was about 200 1 000 u,among which five kinds of amino acids Glu,A
6、rg,Asp,Leu and Phe played an important role in the hydrolysis process of peanut meal protease hydrolysates.Compared with the control group,the KA of the peanut meal protein treated for 120 s remained basically unchanged,while the KM decreased by 14.67%.Under 1 000-fold scanning electron microscope,t
7、he structure of the treated peanut meal protease hydrolysate was damaged.This paper systematically revealed the internal mechanism of the correlation between the changes of key domains of substrate proteins and their enzymolysis properties during the plasma regulation process,which provided a theore
8、tical basis for the preparation of peanut meal proteins with high enzymolysis efficiency and compact structure.Keywords：plasma pretreatment;peanut meal protein;enzymatic hydrolysis characteristics;molecular weight distribution;amino acid composition中图分类号：TS205.7基金项目：河南省科技攻关项目（212102110083）。作者简介：潘宁（1
9、986），男，硕士，助教，研究方向为面制品加工。通信作者：苏东民（1963），男，博士，教授，研究方向为中国传统主食工业化、发酵面制食品。E-mail：。现代食品现代食品XIANDAISHIPIN189189/分析检测分析检测 Analysis and Testing花生粕的营养价值极高，含有氨基酸、蛋白质、糖类等化合物1。研究发现，花生粕具有促进微生物发育和代谢功能，能够促进双歧杆菌的发酵2，还能促进乳酸菌及其他菌类的增殖，并对面包酵母充气有着促进作用。此外，有学者用脱脂花生粕为原料，将其酶解成低分子多肽后与其他辅料经加工制成天然饮品3。我国的花生粕主要产于花生榨油工业中，但由于高温压榨等工
10、艺使花生粕蛋白高度变性4，其功能特性下降，影响了花生粕蛋白在食品工业中的推广应用，目前国内外都在寻找食品工业中有效处理花生粕的方法。等离子体一般用于材料的表面处理，可以改变材料表面的结构及其性能5。在食品领域中，等离子体常被用来对食品进行灭菌、灭酶处理，延长食品的保质期。刘政等6用等离子体对鸡肉进行处理，杀菌率达到96.34%，表明等离子体技术具有显著的杀菌效果。等离子体还可以用于食品体系中的大分子淀粉和蛋白质的改性和优化7。对花生粕进行酶解是一种分离出花生粕中有效物质的重要方法。目前，研究方法主要是利用单酶解制备花生粕多肽，但由于花生粕蛋白质组成和结构比较复杂，在花生粕蛋白酶解时，会出现酶解
11、反应速度慢、水解度较低、水解产物功能性质差等问题，且在单酶酶解过程中所生成的蛋白存在大量疏水性氨基酸残基，影响蛋白的品质，这些问题都限制了花生粕酶解产物的利用价值8-10。因此，寻找一种高效的处理办法是现阶段的研究重点。课题组前期研究发现，Alcalase 碱性蛋白酶对花生粕蛋白具有较好的酶解效果，为系统揭示等离子体对花生粕蛋白酶解特性的影响，本文以花生粕为原料，进行等离子体预处理，根据处理时间的不同，对其水解度、分子量分布、氨基酸组成等指标进行测定，系统揭示等离子体对花生粕蛋白酶解特性的影响。1 材料与方法1.1 材料与试剂花生粕蛋白（粗蛋白 85.4%）；Alcalase 蛋白酶（酶活为
12、3.9105 UmL-1，经福林法测得），Sigma公司；Na2CO3、NaOH、酒石酸钾钠、CuSO4、硼酸钠、NaHCO3、NaH2PO4和 Na2HPO4，天津市大茂化学试剂厂；其余试剂均为国产分析纯。1.2 仪器与设备CTP-2000K 等离子体实验装置，南京苏曼电子有限公司；JSM-76490LV 扫描电子显微镜，日本 JEOL公司；TGL-16 台式高速冷冻离心机，湖南省长沙市望城经济开发区湘仪工业园；L8900 氨基酸分析仪，日立（中国）有限公司；Waters 1525 高效液相色谱仪，美国 Waters 公司。1.3 实验方法1.3.1 花生粕蛋白的等离子体预处理将2 g花生粕
13、蛋白溶解于50 去离子水，配制成质量分数为 10%的花生粕蛋白悬浮液，恒温搅拌 5 min，经功率为 750 W、射频 25 kHz、气体压力 0.18 MPa 的压缩空气、射流出口流速为 30 Lmin-1的等离子体处理机处理（分别处理0 s、30 s、60 s、90 s、120 s和150 s），同时用 1 molL-1 NaOH 溶液调节其 pH 值至 9.0；加入 6 080 Ug-1的 Alcalase 蛋白酶，恒温匀速搅拌，同时添加 NaOH 溶液维持酶解体系的 pH 值不变；在酶解时间为 90 min 时，将酶解液转至 100 水浴中加热 10 min 灭酶，冷却后于 4、8 0
14、00 rmin-1条件下离心10 min 除去沉淀，取上清液，将酶解残渣收集，放入离心机，于温度 4、转速 10 000 rmin-1条件下离心20 min，取残渣，将上清液与酶解残渣冷冻干燥，研磨即得花生粕蛋白。采用 pH-stat 法计算花生粕蛋白的水解度，计算公式为 tot100%bpNMVhDHa=（1）式中：V 为水解过程中氢氧化钠的消耗量，mL；Nb为氢氧化钠的浓度，molL-1；为亚麻籽粕蛋白的平均解离度，在 50、pH 8.5 条件下 为 0.955（无量纲）；Mp为底物中蛋白质的总量，g；htot为底物中每 g蛋白质的肽键总数，亚麻籽粕蛋白的 htot为 8.38，mEq。1
15、.3.2 氨基酸组成分析参考 CHEN 的方法11，对组成花生粕蛋白的氨基酸进行分类，并计算各类氨基酸所占比例。1.3.3 分子量分布的测定参考张艳艳19的方法，采用高效凝胶过滤色谱法测定花生粕蛋白的相对分子质量分布。色谱条件：色谱柱为TSKgel 2000 SWXL（300 mm7.8 mm）；流动相为乙腈水 三氟酸（45 55 0.1）；流速为 0.5 mLmin-1；柱温为 30；进样体积为 20 L；检测波长为 220 nm。1.3.4 对酶解反应动力学研究分别称取 5 gL-1、10 gL-1、15 gL-1、20 gL-1和25 gL-1花生粕蛋白溶液放置在恒温加热磁力搅拌器上50
16、 加热 5 min，后经功率为 750 W 的等离子体表面处现代食品现代食品XIANDAISHIPIN190190/分析检测分析检测Analysis and Testing理机处理 120 s，将处理好的样品置于 50，410 rmin-1的恒温加热磁力搅拌器上，用 1 molL-1 NaOH 溶液调节 pH 值为 9.0，并保持在 9.0 不变，加入 200 L 碱性蛋白酶，前 15 min 每隔 1 min 记一次 NaOH 消耗量，15 min 后每隔 5 min 记录一次 NaOH 消耗量。酶解 70 min 后将酶解液水浴加热至 100，灭酶 10 min。以不经等离子体预处理的为对照组。测定前 15 min 对酶解反应初速度的影响及其对酶解动力学参数的影响。根据 SONG 等12报道的实验方法研究花生粕蛋白的水解动力学得到公式为1/V=KM/(KAET)1/S+1/(KAET)（2）式 中：V 为 反 应 初 速 度，gL-1min-1；KA为 表观分解率常数的平均值或酶与底物结合频率的平均值，min-1；ET为反应体系中酶浓度，gL-1；KM为表观常数（类似于米氏常数），