1、南 开 大 学 学 报（自然科学版）Acta Scientiarum Naturalium Universitatis NankaiensisVol.561Feb.2023第56卷第1期2023年2月文章编号：0465-7942(2023)01-0054-07低剂量ActivinA通过激活CD8+T细胞发挥抗肿瘤效应李建婷1,麻春辉2,韩俊绪2,张旭光2(1.潍坊医学院 医学检验学院,山东 潍坊 261053;2.潍坊医学院附属医院 检验科,山东 潍坊 261031)摘要：Activin A属于转化生长因子-(transforming growth factor-,TGF-)超家族中的多功能细
2、胞因子,存在于多种免疫细胞中.CD8+T细胞是发挥抗肿瘤活性的主要免疫细胞类型.以H22细胞移植瘤模型旨在探讨ActivinA对CD8+T细胞功能的调控和作用机制.本研究首先在分离出的CD8+T细胞上发现Activin A受体及下游信号分子的表达.体外实验表明Activin A对小鼠H22肝癌细胞系的凋亡及增殖无显著影响.H22荷瘤鼠的体内研究发现低浓度Activin A抑制肿瘤生长,高浓度Activin A促进肿瘤生长.在Activin A对肿瘤CD8+T细胞作用的研究中,发现大剂量Activin A处理的肿瘤中CD8+T细胞含量减少,小剂量Activin A处理组中CD8+T细胞含量则增加
3、.以上数据表明,不同剂量的Activin A可能通过调控CD8+T细胞的浸润对肿瘤的生长发挥双重作用.关键词：Activin A;CD8+T细胞;肿瘤中图分类号:R392文献标识码:A0引言Activin,一种25kDa的二聚体糖蛋白1,2,是卵巢和睾丸发育的主要调节因子3.1986年从猪卵泡液中分离出来,因其可以刺激垂体释放促卵泡激素而得名2.与抑制素、肌生长抑制素同属于TGF-超家族4,但Activin以活性蛋白形式分泌3.目前为止,Activin A是五种Activin 中研究最为广泛的一种1,5.Activin A信号传导依赖于Smad蛋白、Activin I型和II型受体6.类受体具
4、有的丝氨酸/苏氨酸激酶活性在其与Ac-tivin结合并招募以及磷酸化I型受体后被激活1,随后活化后的I型受体磷酸化SMAD2/3,与SMAD4结合形成复合物后,转移至细胞核对基因表达进行调控7.Activin A参与多种疾病的发生发展过程并且在不同疾病中的水平不同.如在细菌性脑膜炎15、类风湿性关节炎16、哮喘17、慢性阻塞性肺疾病18-19中发现Activin A浓度增加.在肾上腺皮脂腺瘤,糖尿病、肝病、甲亢和甲减等多种病理状态下以及健康成人中却发现血清中Activin A水平较低20-21.CD8+T细胞,是人体适应性免疫反应的重要组成部分8.活化后的CD8+T细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞
5、(CTL),通过裂解或非裂解途径特异性地识别杀伤靶细胞9-10.CD8+T细胞对于细胞内病原体、机体抗病毒以及抗肿瘤免疫反应具有极其重要的作用11,12,如动脉粥样硬化9、病毒性肝炎13、肺癌以及黑色素瘤等14.Activin A调控多种免疫细胞的功能,从而影响疾病的发生过程5,22-24.Activin A不仅抑制人和大鼠CD4+T细胞的增殖23,25,增强Treg细胞在体内外的抑制潜能促进促肿瘤微环境的产生24;还能促进成熟B细胞增殖和抗原特异性IgE的分泌26,促进单核细胞迁移并刺激其释放肿瘤细胞坏死因子27.研究表明高水平ActivinA能调控人NK细胞的发育过程,而且抑制NK细胞IF
6、N-的产生28.高浓度Activin A能减少小鼠黑色素瘤内CD8+T细胞和NK细胞的浸润,从而促进肿瘤的生长,但对其生物学功能没有影响29.但是在生理状态下和多种疾病中Activin A的水平较低,因而低浓度Activin A对CD8+T细胞功能的调控作用还不清楚.1材料与方法1.1 材料1.1.1 实验试剂和抗体:APC标记的抗小鼠CD3抗体、PE标记的抗小鼠CD8抗体和小鼠CD8a阳性分选试收稿日期：2022-06-19基金项目：山东省自然科学基金青年项目(ZR2021QH311);潍坊医学院附属医院检验科重点学科经费作者简介：李建婷(1997-),女,山东潍坊人,硕士研究生.通讯作者：
7、张旭光(1996-),男,山东海阳人,副教授,研究方向:医学检验技术.E-mail:李建婷等：低剂量Activin A通过激活CD8+T细胞发挥抗肿瘤效应第1期李建婷等：低剂量Activin A通过激活CD8+T细胞发挥抗肿瘤效应 55 剂盒购自加拿大STEMCELL公司;Activin A和APC标记的ActA单克隆抗体购自美国R&D Systems公司;细胞凋亡试剂盒购自武汉普诺赛生命科技有限公司;细胞增殖CCK8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;RT-PCR 试剂盒购自天根生化科技有限公司;引物合成、胶原酶1型、脱氧核糖核酸酶购自生工生物工程股份有限公司1.1.2动物和细胞:雄性C5
8、7BL/6J小鼠,6-8周龄,购自山东省潍坊医学院医学实验动物中心(中国潍坊).小鼠H22肝癌细胞系(Procell CL-0341)由武汉普诺赛生命科技有限公司提供,在5%CO2、37 的饱和湿度培养箱中用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行培养.1.2 方法1.2.1小鼠脾脏CD8+T细胞的分离:6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠处死后,取出脾脏,制成细胞悬液.按照小鼠CD8a阳性分选试剂盒(加拿大STEMCELL公司)说明书进行操作.用抗CD3和抗CD8抗体进行染色,然后进行流式细胞分析,检测纯化得到的细胞中CD8+T细胞百分比.1.2.2 RT-PCR:从纯化的小鼠脾脏细胞
9、中提取RNA.根据基因组试剂盒(TIANGEN)的说明书,进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR).所使用的引物如表1.1.2.3 Activin A受体表达的检测:(1)脾脏/淋巴结:用抗CD3、CD8和ActRA抗体对小鼠脾脏/淋巴结细胞悬液染色然后进行流式细胞分析,检测CD8+T细胞上ActRA的表达.(2)外周血:用抗CD3、CD8和ActRA抗体对小鼠外周血样本进行染色.染色完成后,根据红细胞裂解液(美国Biolegend)说明书进行裂解红细胞步骤.流式细胞仪检测外周血CD8+T细胞上ActRA的比例.(3)Activin A对肿瘤细胞凋亡的影响:H22细胞添加Activin A(0
10、、1、5、25 ng/mL)培养24 h后收集细胞.按照Annexin V-FITC/7-AAD荧光双染细胞凋亡试剂盒(武汉普诺赛)说明书进行细胞凋亡测定.(4)Activin A对肿瘤细胞增殖的影响:H22细胞添加Activin A(0、1、5、25 ng/m)培养24 h后收集细胞.按照CCK-8试剂盒(上海碧云天)说明书进行细胞增殖实验.(5)ELISA:按照小鼠Activin A ELISA检测试剂盒(江苏酶免)说明书检测正常鼠和荷瘤鼠外周血血浆Activin A水平.(6)Activin A对H22荷瘤鼠肿瘤生长的影响:小鼠皮下注射100 L含2106个 H22细胞的无菌生理盐水.7
11、 d后,在注射部位出现质地硬、活动度差的结节,表示接种成功.挑选荷瘤成功的小鼠从第7 d开始连续瘤内注射不同浓度Activin A.实时监测小鼠肿瘤生长情况.第21 d,处死小鼠,观察肿瘤形态并称量肿瘤重量,并且检测小鼠脾脏和肿瘤CD8+T细胞的含量.1.3 统计学分析采用Graphpad Prism 6软件对实验数据进行统计学分析,以P95%,符合研究所需(图1A).富集的CD8+T细胞RT-PCR检测结果显示,小鼠CD8+T细胞表达Activin A受体表1 PCR引物Table 1 PCR primers引物名称Acvr2aAcvr2bSmad2Smad3Smad4GAPDH上游序列(5
12、3)GGTGATAAAGATAAACGGCGACCTTCCTGCGTATCGACATGTACTCTCCAACGTTAACCGAAATGATTCCATTCCCGAGAACACTAAAGTTCACAATGAGCTTGCATTCGGCAAATTCAACGGCACAGTCAAG下游序列(53)AGTTGATATCATCCAGCCAACAAGCATGTACTCATCGACAGGCACCTATGTAATACAAGCGCACTAGGTCCAAGTTATTGTGTGCTTTCAAAGTAAGCAATGGAGCACTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGG 56 南 开 大 学 学 报（自然科学版）第56卷
13、ActRIIA、ActRIIB及其信号分子Smad2,3,4 mRNA(图1B).流式细胞术结果进一步显示小鼠外周血、脾脏、淋巴结CD8+T细胞表达ActRIIA.以上研究结果表明小鼠CD8+T细胞属于ActivinA应答细胞(图1C).2.2ActivinA体外对H22细胞凋亡的影响Activin A对不同肿瘤的生长产生不同调控作用,添加不同浓度Activin A与H22共培养,采用流式细胞术检测Activin A对H22凋亡影响.图2A显示,Activin A对H22凋亡影响作用不明显,差异无统计学意义.HCC添加Activin A(1、5、25 ng/mL)后培养24 h,流式细胞术检测
14、HCC凋亡的百分比(图2B).该图表示3次测定的平均值标准差.2.3ActivinA体外对H22细胞增殖的影响探究Activin A对H22增殖的影响,采用CCK8检测Activin A对H22生长的作用.图3显示,不同浓度Activin A对H22增殖的作用不明显,差异无统计学意义.2.4ActivinA抑制荷瘤鼠肿瘤生长Activin A对不同类型的肿瘤发挥的作用不同,构建小鼠H22移植瘤模型,检测不同浓度的Activin A对肿瘤生长的作用.研究首先采用ELISA检测正常小鼠和荷瘤小鼠血浆Activin A的水平,结果表明正常小鼠和H22移植瘤模型小鼠血浆Activin A水平没有统计学
15、差异,均小于500 pg/mL(图4A).研究进一步表明小剂量Activin A抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长,而高浓度的Activin A对肿瘤的生长具有促进作用(图4B).此外,结果表明与对照组相比较小剂量Activin A处理的小鼠肿瘤重量降低,而高浓度的Activin A处理的肿瘤与对照组相比较肿瘤重量增加(图4C).2.5ActivinA对H22荷瘤小鼠肿瘤内CD8+T细胞的影响进一步检测Activin A在体内对小鼠CD8+T细胞的作用.采用流式细胞术检测小鼠脾脏和肿瘤内CD8+CD3CD8A1020030CqIsotype IgGActRABloodSpleenLymph nodeR
16、0.16SSC1.0K8006004002001.0K80006004002000R20.5R0.11R18.4R0100100100100102102102102104100100100102102104104104104104104101101101101101100102104106106106106106106105103105103103103102105103Q11.63Q298.3Q30.024Q40.0522.5M2.0M1.5M1.0M500K02.5M2.0M1.5M1.0M500K01081081081.0M800K600K400K200K001.0M800K600K400K200KR9.28107CBActRAGAPDHActRBSmad2Smad3Smad4A:通过 CD3 和 CD8 进行染色,检测分离得到的 T 细胞纯度;B:RT-PCR 检测小鼠 CD8+T 细胞 ActRIIA,ActRIIB,Smad2,3,4的表达;C:流式细胞术检测小鼠外周血、脾脏和淋巴结CD8+T细胞ActRIIA的表达图1 小鼠CD8+T细胞ActivinA受体及下游信号分子