1、2256 2023 年第 64 卷第 9 期收稿日期:2022-09-07基金项目:浙江省基础公益技术研究计划(LGN21C200006);浙江省自然科学基金重点项目(LZ22C200006);浙江省“万人计划”(ZJWR0308016)作者简介:张玉(1978),女,山东龙口人,副研究员,博士,研究方向为农产品营养与健康,E-mail:zhyu7711 。通信作者:王伟(1979),内蒙古赤峰人,研究员,研究方向为农产品营养与健康,E-mail:wangwei5228345 。文献著录格式:张玉,李雪,王伟,等.金针菇蛋白源抗氧化肽精准制备条件优化 J.浙江农业科学,2023,64(9):2
2、256-2261.DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.20220954金针菇蛋白源抗氧化肽精准制备条件优化张玉1,2,3,李雪1,2,3,王伟1,白丽萍1,王君虹1(1.浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所,浙江 杭州310021;2.农业农村部农产品信息溯源重点实验室,浙江 杭州310021;3.浙江省食品安全重点实验室,浙江 杭州310021)摘要:为获得制备金针菇蛋白源抗氧化肽的最佳酶解条件,以金针菇蛋白为原料,通过酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶对其进行酶解,以抑制羟自由基能力为评价指标,筛选具有最佳抑制羟自由基能力的蛋白酶。通过
3、酶底比、水底比、酶解温度、pH 值和酶解时间选出最佳单因素酶解条件,再通过响应面优化法进一步优化酶解温度、pH 值和酶解时间 3 个因素。结果显示,最佳金针菇蛋白源抗氧化肽制备实际条件:碱性蛋白酶,酶底比 3%,水底比 15 mLg-1,酶解温度 44.2,pH 值 8.32,酶解时间 4.13 h。所得酶解肽质量浓度在 5.0 mgmL-1时,抑制羟自由基能力为 72.9 UmL-1,总抗氧化能力为 9.6 UmL-1。关键词:金针菇;抗氧化肽;制备;响应面法中图分类号:S646文献标志码:A文章编号:0528-9017(2023)09-2256-06金针菇(Flammulina velut
4、ipes)学名毛柄金钱菌,为担子菌纲、伞菌目、口蘑科、金钱菌属1。金针菇营养丰富,富含蛋白质、维生素、膳食纤维等多种营养成分以及多糖、多酚、萜类等生物活性成分,具有抵抗衰老、降血脂、提高人体免疫力、抗肿瘤等多种生理功能2-7。近年来,对于金针菇中营养成分提取和利用方面的研究越来越受到重视,但主要集中在金针菇多糖提取鉴定以及功能活性方面7-9。对于金针菇蛋白的精准利用研究报道较少。金针菇富含蛋白,蛋白质含量占干物质的 31%,含有 17 种人体所需要的氨基酸,其中 8 种必需氨基酸,占金针菇氨基酸总量的 49.29%51.17%10。生物活性肽是氨基酸以不同组成和排列方式构成的多肽,可以通过酶解
5、食物蛋白质获得,有研究发现多 肽 具 有 抗 氧 化、降 血 糖、抗 炎 等 生 理 活性11-15,目前对于金针菇蛋白的开发利用研究主要是以氨基酸含量、可溶性固形物得率或多肽得率为评价指标16-18。本研究以抑制羟自由基能力为评价指标,通过响应面法优化金针菇蛋白肽酶解制备条件,建立金针菇蛋白源抗氧化肽最佳制备技术,可为金针菇的高值化利用及抗氧化肽的制备提供理论基础和技术支撑。1材料与方法1.1材料与试剂金 针 菇,购 于 杭 州 农 贸 市 场;酸 性 蛋 白 酶(100 Umg-1),上海鼎芬化学科技有限公司;碱性蛋白酶(100 Umg-1),上海如吉生物科技发展有限公司;中性蛋白酶(10
6、0 Umg-1)、木瓜蛋白酶(800 U mg-1)和 胃 蛋 白 酶(30 U mg-1),上海源叶生物科技有限公司;羟自由基测定试剂盒和总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒购自南京建成生物科技公司。1.2仪器与设备分析天平,北京赛多利斯仪器有限公司;紫外分 光 光 度 计,美 国 Perkin Elmer 公 司;MTYK-MI805 pH 计,北京中慧天诚科技有限公司;HZQ-B 恒温培养摇床,苏州威尔实验用品有限公司;HH-4 数显单列四孔水浴锅,金坛市盛蓝仪器制造有限公司;H-1650 型高速离心机,长沙湘仪离心机有限公司;冷冻干燥仪,FD-A10N-50 上海皓庄仪器有限公司。1.
7、3金针菇肽的制备张玉,等:金针菇蛋白源抗氧化肽精准制备条件优化2257金针菇蛋白提取:采用碱溶酸沉法提取金针菇蛋白,称取一定量金针菇干粉,按质量比 1 20 加0.5%的氢氧化钠溶液,50 超声 60 min,4 000 rmin-1离心 15 min,弃去沉淀,上清液以 HCl 溶液调 pH 值至 4.5,离心,去除上清液,沉淀调节pH 值至 7,真空冷冻干燥,得金针菇蛋白。金针菇蛋白酶解肽制备:称取 5.0 g 的金针菇蛋白粉于 150 mL 锥形瓶中,以水底比 15 mLg-1加入蒸馏水搅拌混匀,至酶的最适 pH 值(酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 pH 值分别
8、为 3、9、7、6、2)后,加入 3%的蛋白酶混合均匀,放入摇床中以 150 rmin-1的转速酶解 4 h,酶解温度酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶分别为 40、45、45、55、37 ,酶解过程中保持 pH 值稳定。酶解结束后,沸水浴 5 min 使酶失活,冷却至室温,调 节 pH 值 至 7.0,4 000 r min-1离 心20 min,取上清液真空冷冻干燥后,配成 5.0 mgmL-1溶液,待测活性。1.4抗氧化能力的测定抑制羟自由基能力和总抗氧化能力(T-AOC)测定采用试剂盒法,具体按试剂盒给出的测定步骤进行。1.5单因素酶解条件优化以酶底比 3%、水底
9、比 15 mLg-1、酶解温度45 、酶解体系 pH 值 9.0、酶解时间 4 h 为基本固定因素,改变其中 1 个因素,进行单因素试验,比较不同酶解条件对蛋白酶解肽抑制羟自由基能力的影响。各因素梯度设计为:酶底比(1%、2%、3%、4%、5%),水 底 比(10、15、20、25、30 mLg-1),酶解温度(25、35、45、55、65 ),酶解体系 pH 值(7、8、9、10、11),酶解时间(2、3、4、5、6 h)。1.6响应面分析试验设计 根据单因素试验结果,选择酶解温度、pH 值、时间 作 为 待 优 化 因 子,按 中 心 组 合 试 验 设 计(CCD)原理,采用 Desig
10、n Experts 8.0 软件进行 3因素 5 水平的响应面试验设计,优化金针菇蛋白的酶解条件。以抑制羟自由基能力作为响应值,试验因子水平如表 1。1.7数据统计分析 实验重复 3 次,数据以平均值标准差表示。2结果与分析 2.1蛋白酶选择 表 1响应面分析因素与水平因子水平-1.68-1011.68温度/28.2035455561.80pH 值6.327899.68时间/h2.323455.68不同蛋白酶的酶切专一性不同,所得酶解肽段不同,不同肽段的活性也有所差异。选择酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以酶底比 3%,水底比 15 mLg-1,在最适 pH 值和温度条
11、件下,酶解 4 h。结果表明,不同蛋白酶酶解产物的抑制羟自由基能力不同,经碱性蛋白酶酶解所得金针菇蛋白肽的抑制羟自由基能力最高(图 1),因此,选择碱性蛋白酶作为金针菇蛋白原抗氧化肽制备的蛋白酶。同系列柱上无相同小写字母表示组间差异显著(P0.05)。图 1不同蛋白酶对金针菇蛋白肽抑制羟自由基能力的影响2.2单因素实验2.2.1酶底比对蛋白酶解肽抑制羟自由基能力的影响分别以酶底比 1%、2%、3%、4%和 5%对金针菇蛋白进行酶解,考察酶底比对金针菇蛋白酶解肽抑制羟自由基能力的影响,结果如图 2 所示。当酶底比为 1%3%时,随着酶底比的增加,蛋白酶解肽的抑制羟自由基能力上升,酶底比至 3%以
12、后,抑制羟自由基能力变化趋于平缓,不同酶底比之间差异不显著(P0.05),可能是由于蛋白浓度固定,3%的酶已达到饱和,进一步增加酶,对反应速率影响变小,所以选择酶底比 3%作为适宜酶浓度。2.2.2水底比对蛋白酶解肽抑制羟自由基能力的影响分别以水底比 10、15、20、25 和 30 mLg-1对金针菇蛋白进行酶解,考察不同水底比对金针菇蛋白酶解肽抑制羟自由基能力的影响,结果如图 32258 2023 年第 64 卷第 9 期图 2酶底比对金针菇蛋白肽抑制羟自由基能力的影响所示。当水底比为 10 mLg-1的时候,所得蛋白酶解肽抑制羟自由基能力相对较低,水底比为 15 mLg-1时所得蛋白酶解
13、肽抑制羟自由基能力提高,而后随着水底比增加,所得蛋白酶解肽的抑制羟自由基能力差异不显著(P0.05),可能是水底比为 10 mLg-1时,蛋白浓度过高,影响酶和底物的接触,当水底比达到 15 mLg-1时,酶和底物接触良好,再增加水对其影响较少,故选择水底比为 15 mLg-1作为适宜酶解条件。图 3水底比对金针菇蛋白肽抑制羟自由基能力的影响2.2.3酶解温度对蛋白酶解肽抑制羟自由基能力的影响温度是影响酶活性的重要因素,当温度升高时,酶促反应速率加快,而当超过一定温度后,酶受热变性,其活力减弱,则酶促反应速率降低。分别以酶解温度 25、35、45、55 和 65 对金针菇蛋白进行酶解,考察不同
14、温度对金针菇蛋白酶解肽抑制羟自由基能力的影响,结果如图 4 所示,随着酶解温度的升高,蛋白酶解肽的抑制羟自由基能力呈先上升后下降的趋势,45 下所得蛋白酶解肽抑制羟自由基能力最高,与其他温度差异显著(P0.05),所以选择 45 作为适宜酶解温度。图 4酶解温度对金针菇蛋白肽抑制羟自由基能力的影响2.2.4pH 值对酶解肽抑制羟自由基能力的影响pH 值能通过影响底物分子和酶分子的解离状态,进而影响酶与底物的结合,影响酶解速率,不同的酶具有不同的最适 pH 值。分别以酶解体系pH 值 7、8、9、10 和 11 对金针菇蛋白进行酶解,考察不同 pH 值对金针菇蛋白酶解肽抑制羟自由基能力的影响,结
15、果如图 5 所示。当 pH 值为 8 时,所得金针菇蛋白酶解肽的抑制羟自由基能力最高,与 pH 值为 7 时差异显著(P0.05),因此,选择pH 值 8 为适宜酶解条件。图 5pH 值对金针菇蛋白肽抑制羟自由基能力的影响2.2.5酶解时间对酶解肽抑制羟自由基能力的影响分别以酶解时间 2、3、4、5 和 6 h 对金针菇蛋白进行酶解,考察不同酶解时间对金针菇蛋白酶解肽抑制羟自由基能力的影响,结果如图 6 所示。随着酶解时间的增加,蛋白酶解肽抑制羟自由基能力呈先上升后下降的趋势,在 4 h 时达到最高,与酶解 3 h 差异显著(P0.05),而后有所下降,可能是因为随着酶解时间的增加,一些具有活
16、性的肽进一步被水解,因此,选择 4 h 为适宜酶解时间。2.3响应面分析方法 在实际酶解过程中,各因素相互之间可能会存张玉,等:金针菇蛋白源抗氧化肽精准制备条件优化2259图 6酶解时间对金针菇蛋白肽抑制羟自由基能力的影响在互作影响,根据单因素实验,水底比和酶底比达到一定程度后对酶解产物的影响不显著,且水底比过高,对于后续干燥工艺将增加较高成本,因此,选择酶解温度、pH 值和酶解时间为试验因子,进一步考察各因素之间对目标值的相互影响,按照中心点组合试验设计的统计学要求,设计了 20 组试验来拟合相应曲面的各点,试验的因素和水平设计见表 2。利用 Design Experts 软件对试验数据进行
17、多元回归拟合,获得抑制羟自由基能力与 A(酶解温度)、B(pH 值)和 C(酶解时间)之间的二次多项式回归方程为:Y=71.41-0.73A+3.35B+1.11C-0.76AB-0.96AC-0.56BC-6.58A2-5.22B2-3.86C2(R2=0.989 5)表 2响应面设计方案和试验结果编号A 温度/B pH 值C 时间/h抑制羟自由基能力/(UmL-1)11-1152.62-1.680053.831.680053.2400070.5500-1.6859.5611-156.9701.68063.58001.6862.99-11-158.610-1-1155.111-11161.9
18、12-1-1-149.81300071.6140-1.68051.21511156.11600072.5171-1-150.91800070.91900072.32000070.4由表 3 的方差分析结果可知,所得回归模型的F 值为 104.59,P0.000 1,说明回归模型具有高度的显著性,失拟项 P 值为 0.204 9,表明该模型失拟不显著,回归方程模型与实际试验拟合性好,可靠性较高,可以用此模型对金针菇蛋白酶解效果进行分析及预测。酶解温度和酶解时间的交互作用显著,表明适当的调整酶解温度和时间,有助于所得活性肽抑制羟自由基能力的提高。各因素相互影响曲面图和等高线图见图 7,结果显示,本
19、研究的目标最高值在中心点附近,中心点设置合理。表 3响应面回归模型的方差分析结果因子平方和自由度均方F 值P 值模型1 235.169137.24104.590.000 1A-A7.1917.195.480.041 3B-B153.501153.50116.980.000 1C-C16.96116.9612.920.004 9AB4.6514.653.540.089 1AC7.4117.415.650.038 8BC2.5312.531.930.195 0A2624.561624.56475.980.000 1B2392.991392.99299.500.000 1C2214.811214.8
20、1163.710.000 1残差13.12101.31失拟项9.0151.802.190.204 9总和1 248.2819经 Design Experts 分析,所得模型最佳酶解条件为 A(酶解温度)=-0.08,B(pH 值)=0.32,C(酶解时间)=0.13,所对应的实际条件为酶解温度为 44.2 ,pH 值为 8.32,酶解时间 4.13 h,水底比 15 mLg-1、酶底比 3%,模型预测此条件下所得酶解产物抑制 羟自由基能 力为 72.0 U mL-1。为验证模型预测值的可靠性,在所得最佳条件下进行验证试验,所得酶解肽抑制羟自由基能力为 72.9 UmL-1。说明此响应面分析法优
21、化所得参数条件准确可靠。3讨论与结论羟基自由基和超氧阴离子等自由基都是通过不同的代谢反应产生的,在信号转导中发挥重要作用,但过量的自由基可与生物大分子发生反应,导致细胞损伤,引发多种健康问题19-21。抗氧化剂可通过向自由基提供电子,清除过多的自由基22。由于合成抗氧化剂具有一定的毒性,随着人们对健康的关注,天然抗氧化剂已成为研究热点,目前已从动植物中获得了多种抗氧化肽20-23。金针菇富2260 2023 年第 64 卷第 9 期图 7响应面图和等高线图含蛋白,目前对金针菇及金针菇蛋白酶解工艺已有部分研究,李桂峰等15 通过响应面法对金针菇蛋白酶 解 制 备 抑 菌 肽 的 工 艺 进 行
22、了 优 化,林 群 英等18 以可溶性固性物的得率为评价指标,优化了金针菇酶解条件,并研究了最终酶解物对线虫氧化应激能力的影响,该研究所用材料为金针菇,所得酶解产物成分复杂,产物冻干粉中蛋白含量仅为24.35%。本研究以金针菇蛋白为原料,研究金针菇蛋白制备抗氧化肽的最佳条件,由于不同蛋白酶的底物特异性不同,酶解蛋白所得的产物也就不同,因此,实验以酶解所得肽的抑制羟自由基能力为评价指标,对酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶进行筛选,结果显示,碱性蛋白酶酶解所得蛋白酶解肽抑制羟自由基能力最佳。因此,选择碱性蛋白酶通过单因素实验进一步对酶底比、酶解温度、时间、pH 值和水底比等
23、酶解条件进行优化,得到最佳单因素条件为酶解温度 45 ,pH 值 8,酶 解 时 间 4 h,酶 底 比3%,水底比 15 mLg-1。由于不同酶解工艺参数之间可能会存在交互作用,响应面分析法是利用合理的试验设计方法,采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析预测最优参数,它具有预测准确、精度高等优点,已在动植物源蛋白酶解肽制备研究方面进行了一定的应用16,24-25,本实验在单因素的基础上进一步通过响应面优化法对酶解温度、酶解时间、酶解 pH 值进行优化,实现所得酶解肽的抗氧化活性最大化。所得最佳酶解实张玉,等:金针菇蛋白源抗氧化肽精准制备条件优化2261际条
24、件为:碱性蛋白酶,酶解温度 44.2 ,pH 值8.32,酶 解 时 间 4.13 h,酶 底 比 3%,水 底 比15 mLg-1。对此最佳实验条件下所得金针菇蛋白酶解肽进行活性测定,其抑制羟自由基能力与预测值具有较高的吻合度,说明该模型具有较好的预测准确性,可用于金针菇蛋白源抗氧化肽的制备工艺优化。所得金针菇蛋白酶解肽在 5.0 mgmL-1时,抑制羟自由基能力为 72.9 UmL-1,总抗氧化能力为 9.6 UmL-1,具有较好的抗氧化能力,因此,经蛋白酶消化后的金针菇蛋白具有更广阔高附加值应用前景,所得的最佳酶解工艺可为金针菇蛋白精深加工及高值化利用提供一定的研究基础。参考文献:1 毕
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