1、解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 1 ELISAELISA 检测实验检测实验方法方法 1.1.实验原理实验原理 ELISA 是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自 70 年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶
2、的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。解螺旋 http:/ 1.测定体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等；2.测定激素，包括小分子量的甾体激素等；3.测定抗生素和药
3、物；4.测定病原体抗原，HBsAg、HBeAg 等；5.利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs 等；解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 2 3.3.实验实验材料材料 3.1.3.1.主要试剂主要试剂（试剂来源仅供参考）（试剂来源仅供参考）试剂试剂 配方配方 包被液 PH=6.3 的碳酸盐缓冲液。无水 Na2CO2 0,1696g,NaHCO3 0.2856g,超纯水 100ml。完全溶解后放到 4OC 一周内使用。PBST Nacl 8.0g,Na2HPO4.12H20 2.9g,KCI 0.2g,KH2PO4 0.24g,吐温 20 0.5 ml,超纯水 1000 ml。底物缓冲
4、液 0.2mol/L Na2HPO4 25.7 ml,0.1 mol/L 柠檬酸，24.3 ml,超纯水 50ml 3%H2O2 30%H202 100 ml,超纯水 900 ml 显色剂 底物缓冲剂 10ml,3%H202 150ul,OPD 15 mg,其中 H202最后加。终止液 将 1X 的浓硫酸缓慢加入到超纯水中，并搅拌散热 解螺旋 http:/ 仪器名称仪器名称 来源来源 型号型号 离心机 Thermo Fisher Scientific Micro17R ELISA 板 Thermo Fisher Scientific 143761 酶标仪 BioTek Epoch-256600
5、 3.3.3.3.其他（请具体写明）其他（请具体写明）本步骤为间接 ELISA 步骤。4.4.实验步骤实验步骤 1.包被：取所要包被的物质，提前设计好所需浓度，根据包被孔数计算所需包被物的量，用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中。包被条件：两种选择：一是将 ELISA 板直接臵 4过夜；也可以先臵 37孵育 2 小时再转入 4过夜。2.洗涤：包被结束后弃掉包被液，用 PBST 进行洗涤，方法为 PBST 加满每孔，静置 5-10min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤 3-5 次，最后拍干 ELISA 板等待下一步封闭。解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 3 3.封闭：常用 10%小牛血清，取
6、第 2 步的 ELISA 板加封闭液至每孔，体积至少为所加包被液的两倍。封闭条件也有两种选择：直接置于 4oC 过夜，或者置于 37oC 温育 2-4h，具体何种条件不同物质的 ELISA 可能不同。4.洗涤：封闭结束的 ELISA 板进行洗涤，方法同步骤 2.最后拍干等待加入一抗。5.加入一抗：一抗即为你要检测的物质，一般加之前需要稀释，具体稀释倍数不同，不同实验需要自己摸索，一抗样品一般用包被稀释液，稀释到所需浓度后加入到相应孔中，反应条件为 37oC 孵育 2h。6.洗涤，具体步骤同 4。解螺旋 http:/ HRP-标记的商品化二抗（如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一般也用封闭液稀
7、释，稀释倍数参考二抗说明书，将稀释好的二抗加入各孔，37oC 反应 1-1.5h。8.洗涤：具体步骤同 4。9.显色：常用 OPD 作为显色底物。显色需要配置显色液，具体方法为：在步骤 8 进行到一半使用配置显色液，为 10 ml 的底物缓冲液加 0.015g OPD 粉末，等待 OPD 完全溶解。待步骤 8 完成后取 150 ul 3%过氧化氢溶液加入之前配置的 10 ml 溶液中混匀，立即将此显色液分加至 ELISA 各孔中，然后将 ELISA 板置于 37OC 反应约 10 min。10.终止：将 ELISA 板取出，每孔加终止液（2 mol/L 硫酸溶液）终止反应，立即到酶标仪上读数（
8、OPD 为底物是读数波长 490 nm，TMB 为底物时波长为 450 nm）。11.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测 OD 值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm 处，以空白对照孔调零后测各孔 OD 值。附：附：E ELISALISA 样本的处理方法样本的处理方法 解螺旋 http:/ 离心 20min,除去细胞碎片及杂质，取上清，-20OC 或者-80OC 保存。避免反复冻融。2.细胞裂解液 1）吸去培养板内的培养基，用胰酶消化细胞，加适量培养基将细胞从培养板上吹下来，悬浮细胞。2）收集细胞悬液，1000Xg
9、离心 10 min,弃去培养基，用预冷的 PBS 润洗 3 次。3）加入适量的预冷 PBS 或细胞裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。通常 6孔板一个孔的细胞量需要 150-250ul PBS 重悬。解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 4 4）将样品放入-20OC 或者-80OC，使样品冷冻，再放入室温解冻样品，反复冻融几次，使得细胞充分裂解。也可以将样品进行超声破碎，以达到裂解的目的。3.组织匀浆液 1）将组织样本用 PBS(0.01 M,PH 7.4)冲洗，洗去组织表面残留的血液或杂质。2）将组织块称重，记录后剪碎，碎块应尽量小，便于匀浆得更充分 3）将组织按一定的比例加入预冷的
10、 PBS（临用前加入蛋白酶抑制剂）匀浆，匀浆时置于冰上或者冰浴中（通常按组织重量：PBS 体积=1：9 的比例匀浆，例如 1g 的组织样本对应9 ml 的 PBS,具体体积可以根据实验需要适当调整，检测后计算样品浓度时应乘以相应的稀释倍数）4）吸取匀浆液到离心管，4OC 5000Xg 离心 5-10min,取上清，-20OC 或者-80OC 保存，避免反复冻融。解螺旋 http:/ 1 1.Fortea J,Carmona-Iragui M,Benejam B,et al.Plasma and CSF biomarkers for the diagnosis of Alzheimers disease in adults with Down syndrome:a cross-sectional study.Lancet Neurol 2018;1717(10):860-9.