1、HIV实验室检测技术 张家口市疾病预防控制中心 刘琪琛 2022.5.26 窗口期的意义 窗口期：广义的讲，从病原体侵入机体到用现行窗口期：广义的讲，从病原体侵入机体到用现行的实验室手段可以证明受到感染的期限称为窗口的实验室手段可以证明受到感染的期限称为窗口期。期。狭义的讲，狭义的讲，HIV感染后至抗体检出前的一感染后至抗体检出前的一段时间称为窗口期。检测段时间称为窗口期。检测HIV感染的实用方法是感染的实用方法是检测抗检测抗-HIV，在免疫功能正常人群，其窗口期为，在免疫功能正常人群，其窗口期为2-12周。周。正确选择检测时机正确选择检测时机通常在危险暴露后通常在危险暴露后3个月检测，个月检
2、测，把握度在把握度在95%以上以上 正确解释检测结果正确解释检测结果-阴性只能说明阴性只能说明3个月以前没遭个月以前没遭受感染，不可以说“检测没事儿受感染，不可以说“检测没事儿“平安用血平安用血只是相对做到平安，因处于窗口期的只是相对做到平安，因处于窗口期的供血，检测不到抗供血，检测不到抗-HIV。HIV感染急性期感染急性期早期早期：病症出现在感染后：病症出现在感染后6周以周以内，类似感冒，出现异常淋巴细胞升高内，类似感冒，出现异常淋巴细胞升高 潜伏期：感染到潜伏期：感染到AIDS发病前，数月发病前，数月-10年以上。抗年以上。抗-HIV阳性、阳性、P24抗原或病毒别离在早期阳性，以后抗原或病
3、毒别离在早期阳性，以后不定或阴性，核酸检测由阳性到不确定到阳性不定或阴性，核酸检测由阳性到不确定到阳性 艾滋病早期：持续发热、持续淋巴结肿大、可以有艾滋病早期：持续发热、持续淋巴结肿大、可以有持续性腹泻；体重减轻，可以发生时机性感染持续性腹泻；体重减轻，可以发生时机性感染 艾滋病期：保持和开展艾滋病期：保持和开展AIDS早期病症，出现多种时早期病症，出现多种时机性感染，神经细胞和功能损伤的表现，易发生机性感染，神经细胞和功能损伤的表现，易发生多种肿瘤多种肿瘤 x AIDS的病程通常的病程通常2年年 关于检测抗关于检测抗-HIV的剩余危险度的剩余危险度 含义：在目前条件下，筛查后仍具感染性的机率
4、含义：在目前条件下，筛查后仍具感染性的机率 称为剩称为剩余危险度。余危险度。影响因素：影响因素：x 窗口期和检测时机的选择问题窗口期和检测时机的选择问题 x 实验室质控实验室质控 x 个别人免疫功能低下，对个别人免疫功能低下，对HIV无反响无反响 x 试剂质量和保存问题试剂质量和保存问题 x 是否在有效期内使用是否在有效期内使用 x 试验操作错误：标本或结果登记的过失、仪器校准否、试验操作错误：标本或结果登记的过失、仪器校准否、错误的操作错误的操作 前病毒 HIV进入宿主靶细胞后，病毒RNA利用自身的逆转录酶进行逆转录，合成病毒基因组的双链DNA分子。在整合酶的作用下在细胞核内，双股DNA整合
5、入宿主细胞染色体DNA中，这种整合的病毒双股DNA即称为前病毒。抗抗-HIV初筛试验结果的解释和处理初筛试验结果的解释和处理 抗抗-HIV阳性：极大可能为阳性：极大可能为HIV感染，也可能属于非特异反响感染，也可能属于非特异反响 抗抗-HIV弱阳性：存在真阳性和假阳性两种可能弱阳性：存在真阳性和假阳性两种可能 抗抗-HIV阴性：极大可能无阴性：极大可能无HIV感染，不排除阳性的可能感染，不排除阳性的可能存在感染因存在感染因素下检测时机不适宜素下检测时机不适宜 通常的抗通常的抗-HIV检测结果的处理检测结果的处理 结果结果 试剂试剂1 试剂试剂2 处理意见处理意见 A 再次采样，做确证实验再次采
6、样，做确证实验 B 或或 再次采样，做确证实验再次采样，做确证实验 C 报告抗报告抗-HIV阴性阴性 D 不必复检不必复检 报告抗报告抗-HIV阴性阴性 疫情报告疫情报告 x 责任疫情报告人：?中华人民共和国传染病防治法?及其实施方法规定，执行职务的医疗保健人员、卫生防疫人员是传染病责任疫情报告人。x 报告时限和方法：责任疫情报告人发现AIDS患者、疑似AIDS患者或无病症HIV感染者时，城镇于6小时内、农村于12小时内，以最快的通讯方式向当地卫生防疫机构报告，并同时报出传染病报告卡。HIVHIV抵抗力抵抗力 HIVHIV一旦离开宿主在外界环境中生存能一旦离开宿主在外界环境中生存能力便很快消失
7、，力便很快消失，HIVHIV对环境中的物理因对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比乙肝素和化学因素抵抗力均较弱，比乙肝病毒病毒HBVHBV的抵抗力低得多。因此，的抵抗力低得多。因此，对对HBVHBV有效的消毒和灭活方法均适用于有效的消毒和灭活方法均适用于HIVHIV。HIVHIV抵抗力抵抗力-物理因素 HIVHIV对热很敏感，对低温的耐受性对热很敏感，对低温的耐受性强于高温。因此，可以用高温灭活强于高温。因此，可以用高温灭活HIVHIV，在低温条件下保存，在低温条件下保存HIVHIV。对紫外线不敏感：用紫外线、对紫外线不敏感：用紫外线、射射线不能灭活线不能灭活HIVHIV。HIVHIV抵
8、抗力抵抗力-物理因素 HIVHIV灭活：美国疾病控制中心证明，在枯燥灭活：美国疾病控制中心证明，在枯燥环境中的环境中的HIV HIV 浓度在几小时之内降低浓度在几小时之内降低909099%99%即降低即降低1 12 log 2 log。在室温。在室温22222727液体环境下液体环境下HIVHIV可存活可存活1515天以上；经天以上；经5656处理处理3030分钟，可使分钟，可使HIVHIV在体外对人在体外对人T T淋淋巴细胞失去感染性，但不能完全灭活血清巴细胞失去感染性，但不能完全灭活血清中的中的HIVHIV；血清中；血清中HIVHIV经过经过603603小时或小时或80308030分钟作用
9、后不能检出感染性分钟作用后不能检出感染性HIVHIV。目。目前，世界卫生组织推荐的逆转录病毒灭活前，世界卫生组织推荐的逆转录病毒灭活方法是方法是1002010020分钟。分钟。HIVHIV抵抗力抵抗力化学因素 HIVHIV耐碱不耐酸：在耐碱不耐酸：在pH3.0pH3.0条件下条件下HIVHIV滴滴度在度在1010分钟可下降分钟可下降4 4个对数级，而个对数级，而pHpH值值高达高达9.09.0时，时，HIVHIV滴度下降甚微。滴度下降甚微。对含氯消毒剂敏感。对含氯消毒剂敏感。0.50.5次氯酸、次氯酸、2 2戊二醛溶液、戊二醛溶液、3 3碘酒、碘酒、6 6过氧化过氧化氢可在氢可在3 35 5分
10、钟内灭活分钟内灭活HIVHIV。实验常用的消毒方法实验常用的消毒方法 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 (121 20(121 20分钟分钟)干烤干烤 170 2170 2小时小时 煮沸煮沸 2020分钟分钟 消毒剂浸泡消毒剂浸泡3030分钟，常用消毒剂为分钟，常用消毒剂为5 5可用可用氯氯(次氯酸钠、次氯酸钾、氯氨次氯酸钠、次氯酸钾、氯氨T)T)、6 6过过氧化氢、氧化氢、2 2戊二醛等。戊二醛等。70%70%酒精酒精1 1分钟可灭分钟可灭活活HIVHIV。二、实验室检测技术二、实验室检测技术 HIV感染实验室诊断感染实验室诊断 HIV感染实验室检测方法：、血清学检测、HIV核酸检测、病毒别离、CD
11、4 T 淋巴 细胞计数等 目前最常用的方法为HIV特异性抗体的检测。检测标本 主要为血液，包括血清、血浆和全血；此外还可用唾液检测HIVOrasure，如Salivacard，尿液检测HIV抗体。标本的采集标本的采集、运送和处理运送和处理 标本采集标本采集:用一次性注射器用一次性注射器或真空采或真空采血管血管抽取一定量静脉血抽取一定量静脉血，室温下自然室温下自然放置放置12h，待血液凝固待血液凝固、血块收缩后再血块收缩后再用用3、000r/min离心离心15min，吸出血清备吸出血清备用用。用加有抗凝剂的真空采血管用加有抗凝剂的真空采血管或一次性或一次性注射器抽取静脉血注射器抽取静脉血，转移至
12、加有抗凝剂转移至加有抗凝剂的试管的试管，反复轻摇反复轻摇，别离血浆和血细别离血浆和血细胞备用胞备用。用于核酸定性检测时用于核酸定性检测时，采集的抗凝全血采集的抗凝全血应在应在48h内别离内别离PBMC和血浆和血浆，否那么否那么应在应在2448h内别离血浆和血细胞内别离血浆和血细胞。采集样品本卷须知 采集样品原那么上应按临床采血技术标准操作。采集样品时应注意平安，建议采用真空采血管及蝶形针具，以防止直接接触血液；直接接触HIV感染者/艾滋病AIDS病人血液/体液的操作,应戴双层手套。标本运送：标本运送：运送血清或血浆标本应灭活运送血清或血浆标本应灭活56 30min 灭活灭活，用带盖的试管严密封
13、，用带盖的试管严密封口，试管上应标明样品的编号或受检口，试管上应标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。随样品应者姓名、种类和采集时间。随样品应附有“送检单附有“送检单和“生物样品检测委和“生物样品检测委托书托书，送检单与生物样品检测委托，送检单与生物样品检测委托书应与标本分开。如果路程较远或气书应与标本分开。如果路程较远或气候炎热，应在候炎热，应在2-8条件下运送。用于条件下运送。用于抗体检测的样品可在短期内抗体检测的样品可在短期内48小时小时室温递送。标本应专人用送。室温递送。标本应专人用送。收样单位：详细地址：邮政编码：联系人：联系电话：送样单位：详细地址：邮政编码：联系人：联系电话
14、：用于用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品应淋巴细胞测定的样品应在室温下在室温下18 23运送。运送。应采用应采用WHO提出的三级包装系统提出的三级包装系统 第一层容器：装样品，要求防渗漏。样品应置于带第一层容器：装样品，要求防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。随样品应附有围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。随样品应附有送检单，送检单应与样品分开放置。送检单，送检单应与样品分开放置。第二层容器：要求耐受
15、性好、防渗漏、容纳并保护第二层容器：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可以装假设干个第一层容器。将试管第一层容器，可以装假设干个第一层容器。将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。理。第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。在第三层容器外面要贴标签消毒。在第三层容器外面要贴标签数量，收、发数量，收、发件人件人 一、血清学检测 血清学检测即抗体、抗原检测 HIV抗体诊断 临床上实际应用的是测定特异性HIV抗体，包括初筛和确认两个方面。HIV抗体一般在感染后几周逐渐出现，可延续
16、至终身，是重要诊断依据，但是从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为1到3个月，还有一小局部比例的HIV感染者出现缓慢反响，95%以上HIV-1感染者产生抗体的时间是在感染后6个月以内。抗体检测方法 酶联免疫吸附试验ELISA 明胶颗粒凝集试验PA 斑点免疫试验 胶体金或胶体硒 间接免疫荧光IFAT HIVHIV抗体检测的要点抗体检测的要点 1 筛查试验阳性不能出阳性报告；2 严格遵守实验室标准操作程序SOP 3 严格按照试剂盒说明书操作；4 注意防止样品间交叉污染。HIV抗体检测开展历史 1985年4月首次检测HIV-1抗体的ELISA药盒开始供市，不久又建立起WB免疫印迹法等确认试验。其他技术如乳胶和明胶颗粒凝集试剂测定HIV-1抗体的初筛方法也相继研制成功，这样不仅提供了HIV/AIDS的临床诊断依据，而且明显地减少了输血后HIV感染的危险性。一、酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法 捕获法 竞争法 ABS-ELISA法 双抗体夹心法 双抗原夹心法HIV抗体筛查常用方法 双抗原夹心法 目前我国常用的HIV抗体筛查方法是酶联免疫试验(ELISA)双抗原夹心法第三代试剂 第四代ELI