1、宝生物工程宝生物工程大连大连,116600,116600 TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.cDNA cDNA 5 5RACE 法 端的快速扩增法(RACE:Rapid Amplification of cDNA Ends)目目 的的 扩增扩增55端未知的端未知的 基因基因DNADNA序列序列 报报 告告 内内 容容 使用试剂与方法使用试剂与方法 实实 验验 例例 实验使用的主要试剂实验使用的主要试剂 1.1.TaKaRa 5TaKaRa 5 2.2.TaKaRa LA Taq TaK
2、aRa LA Taq 酶酶 3.3.5 5条条DNADNA扩增用引物扩增用引物 4.4.切胶回收试剂盒切胶回收试剂盒 -Full RACE Core SetFull RACE Core Set Self-Ligation 法法 5 RACE原理原理 5 RACE 的实验方法的实验方法 1.1.反转录反转录RTRT反响。反响。2.2.Hybrid RNAHybrid RNA的分解。的分解。3.3.单链单链cDNAcDNA的自身连接。的自身连接。4.4.PCRPCR扩增扩增5 5未知区域。未知区域。5.5.目的目的DNADNA片段的切胶回收。片段的切胶回收。6.6.DNADNA序列测定。序列测定。
3、1.1.体外转录体外转录PSPtet RNAPSPtet RNA。2.2.配制配制PSPtet RNAPSPtet RNA和人总和人总RNARNA的混合样品。的混合样品。3.3.设计合成设计合成5 5条引物。条引物。4.4.使用使用5 5 RACERACE法获取法获取PSPtet RNAPSPtet RNA的的5 5末端。末端。5.5.切胶回收目的切胶回收目的DNADNA片段。片段。6.6.进行进行DNADNA测序确认序列结果。测序确认序列结果。获取获取PSPtet RNA的的5末端末端 实实 验验 例例 PSPtet RNA 体外转录体外转录 PSPtet RNA的电泳结果的电泳结果 1：P
4、SPtet RNA M：DL2,000 Marker 1 M RNA Mixture 的配制的配制 将将PSPtetPSPtet RNARNA与人总与人总RNARNA按按1 1 ：10105 5 的比例混合的比例混合，此混此混 合物用于合物用于5 5 RACERACE实验。实验。人总人总 RNA的电泳结果的电泳结果 1 M 1:Human Total RNA M:Hind III Marker PSPtet RNA的的5端序列端序列 AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGT
5、TAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGC
6、GACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACC
7、GATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTAT 五条引物与五条引物与PSPtet RNA的位置关系图的位
8、置关系图 未知未知 序列序列 5 3 5条引物的详细序列条引物的详细序列 RT Primer：5-(p)AAAATGACCCAG-3 F1 Primer：5-GTCCTGTGGATCCTCTACGC-3 R1 Primer：5-AGCCACTATCGACTACGCGAT-3 F2 Primer：5-AGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTG-3 R2 Primer：5-CTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATA-3 1.1.体外转录体外转录PSPtet RNAPSPtet RNA。2.2.配制配制PSPtet RNAPSPtet RNA和人总和人总RNARNA的混合样品
9、。的混合样品。3.3.设计合成设计合成5 5条引物。条引物。4.4.使用使用5 5 RACERACE法获取法获取PSPtet RNAPSPtet RNA的的5 5末端。末端。5.5.切胶回收目的切胶回收目的DNADNA片段。片段。6.6.进行进行DNADNA测序确认序列结果。测序确认序列结果。获取获取PSPtet RNA的的5末端末端 实实 验验 例例 5 RACE 的实验方法的实验方法 1.1.反转录反转录RTRT反响。反响。2.2.Hybrid RNAHybrid RNA的分解。的分解。3.3.单链单链cDNAcDNA的自身连接。的自身连接。4.4.PCRPCR扩增扩增5 5未知区域。未知
10、区域。5.5.目的目的DNADNA片段的切胶回收。片段的切胶回收。6.6.DNADNA序列测定。序列测定。Step1.反转录反响反转录反响 RNA Mixture 10RT Buffer RNase Inhibitor(40 U/m ml)AMV Reverse Transcriptase XL(5 U/m ml)5 磷标记反转录引物磷标记反转录引物(200 pmol/m ml)RNase Free dH2O up to 30 10 分钟分钟 50 30 分钟分钟 80 2 分钟分钟4 保存保存 1.1.反响液组成反响液组成:2.2.反响条件反响条件:3.0 m mg 1.5 m ml 0.5
11、 m ml 1.0 m ml 1.0 m ml 15 m ml Step2.Hybrid RNA的分解的分解 1st Strand cDNA反响液反响液 5Hybrid RNA Degeneration Buffer RNase H(60 U/ml)dH2O up to 30;1 小时小时乙醇沉淀乙醇沉淀 1.1.反响液组成反响液组成:2.2.反响条件反响条件:15 m ml 15 m ml 1 m ml 75 m ml Step3.单链单链 cDNA 的自身连接反响的自身连接反响 Step2 的的 cDNA 沉淀物沉淀物 5RNA(ssDNA)Ligation Buffer dH2O 40%
12、PEG#6000 T4 RNA Ligase(40 U/m ml)16;过夜反响过夜反响 1.1.反响液组成反响液组成:2.2.反响条件反响条件:8 m ml 12 m ml 20 m ml 1 m ml Step4.PCR 反响反响(1st PCR)Step3 的连接反响液的连接反响液 10LA PCR Buffer II dNTP Mixture(2.5 mM each)Primer F1(20 mM)Primer R1(20 mM)TaKaRa LA Taq(5 U/ml)dH2O up to 1.1.反响液组成反响液组成:2.2.反响条件如下反响条件如下:1.0 m ml 5.0 m
13、ml 8.0 m ml 0.5 m ml 0.5 m ml 0.5 m ml 50 m ml 94 3 min 94 30 sec 55 30 sec 72 30 sec 25 Cycles Step4.PCR 反响反响(2nd PCR)1st PCR 反响液反响液 10LA PCR Buffer II dNTP Mixture(2.5 mM each)Primer F2(20 mM)Primer R2(20 mM)TaKaRa LA Taq(5 U/ml)dH2O up to 1.1.反响液组成反响液组成:2.2.反响条件如下反响条件如下:1.0 m ml 5.0 m ml 8.0 m ml
14、 0.5 m ml 0.5 m ml 0.5 m ml 50 m ml 94 30 sec 55 30 sec 72 30 sec 30 Cycles 2nd PCR反响结果反响结果 M 1M 1 M:DL2000 Marker 1：PCR产物产物 切胶回收电泳结果如下切胶回收电泳结果如下 1：回收回收DNA片段片段 M：DL2000 Marker 1 M Step5.目的目的 DNA 片段的切胶回收片段的切胶回收 Step6.DNA 片段的序列测定片段的序列测定 未知未知 序列序列 5 3 测序结果与测序结果与五条引物五条引物间的关系间的关系 PSPtet RNA的的5端序列端序列 AATA
15、CAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCA
16、CTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCC