1、实验研究啶虫脒对小鼠睾丸间质细胞活力、凋亡的影响及其机制探讨刘芙，王鑫，袁宁，马跃，马明月，毛亚萍（通信作者）沈阳医学院公共卫生学院卫生检验学教研室，辽宁 ；沈阳医学院公共卫生学院毒理学教研室基金项目：国 家 级 大 学 生 创 新 创 业 训 练 计 划 项 目（；）；环境与儿童健康教育部和上海市重点实验室开放项目（）作者简介：刘芙（），女，在读本科生，卫生检验与检疫专业，研究方向：啶虫脒致生殖毒性机制研究通信作者：毛亚萍，：摘要：目的探讨啶虫脒（）对小鼠睾丸间质细胞 的活力、凋亡的影响及其作用机制，为 生殖毒性及机制研究提供线索。方法以、分别加入小鼠睾丸间质细胞 细胞（、组）中作用，法检测
2、细胞活力，检测 、及磷脂酰肌醇激酶（）、蛋白激酶（）、叉头框蛋白（）。结果与 组比较，、组细胞存活率均降低，差异有统计学意义（均 ）。与 组比较，、组 升高，、组 、升高（均 ）。与 组比较，、组 升高（分别为 、，均 ），、组 升高（分别为 、，均 ），、组 升高（均 ）。结论 可导致 细胞活力降低，剂量越高作用越强；低剂量 可促进 细胞凋亡，高剂量 可抑制细胞凋亡；高剂量 可能通过调控 信号通路发挥抗凋亡作用。关键词：啶虫脒；新烟碱类杀虫剂；睾丸间质细胞；生殖毒性；细胞活力；细胞凋亡 ：中图分类号：文献标识码：文章编号：（），；，：（），（，），（），（），（，），（，），（），：；啶虫脒
3、（）是应用最广泛的新烟碱类杀虫剂（）之一，通过选择性作用于烟碱型乙酰胆碱受体（），导致昆虫因异常兴奋而死亡。大量应用导致的环境问题日益凸显。一项关于中国成年人饮食 暴露情况调查显示，饮食样本中 种 被检测到，其中 和吡虫啉（）检测率较高。一项对我国 个城市共 份尿液样品中 的检测结果显示，尿液中 检出率为 以上，表 明 广 泛 应 用 导 致 了 人 群 的 普 遍 暴露。近年，对哺乳动物的生殖毒性已成为研究重点。动物实验研究发现，暴露可导致雄性大鼠血浆睾酮浓度和精子质量显著下降，睾酮合成关键预防医学论坛 年月第 卷第期 ，基因 、表达下调，从而损害大鼠生殖能力。但目前 对生殖系统毒性作用的研
4、究较少，相关机制并不明确。年 月，本研究利用小鼠睾丸间质细胞 ，在体外探究 对细胞活力、凋亡的影响及其作用机制，为 致生殖毒性机制研究提供线索和理论基础。材料与方法 材料小鼠睾丸间质细胞（中国科学院上海生科院细胞资源中心），（纯度）（，中国），培养基、胎牛血清（，美国），、胰酶、青霉素 链霉素（双抗，美国），（诺唯赞，中国），（生工生物，中国），（）、（，日本）等。细胞培养及 干预应用 培养基（含 和双抗）培养 细胞。称取一定重量的 ，溶于，再将其进一步溶于相应体积的 培养基中，配制成浓度为、的 溶液（终浓度不超过 ）。将不同浓度 溶液分别加入 细胞（、组）。细胞活力的检测采用 法。细胞接种于
5、 孔板，待细胞量长至约，分别将、加入 细胞，弃去旧培养液，每孔加入 溶液和 培养液，混匀，于 继续培养，利用酶标仪于 波长处测吸光度（）值，计算细胞存活率。细胞 、及细胞磷脂酰肌醇激酶（）、蛋白激酶（）、叉头框蛋白（）相对表达量的检测 采用 法。细胞接种于孔板，待细胞量长至约，将、分别加入 细胞。用 法提取总 ，测定 浓度，取为 模 板 进 行 反 转 录（），反 转录的 再 用 （）进行 分析。所用基因 引 物 如 下：上 游 引 物 ，下 游 引 物 ；上 游 引 物 ，下 游 引 物 ；上 游引 物 ，下游引物 ；上 游 引 物 ，下 游 引 物 ；上游引物 ，下游引物 ；上游引物 ，下
6、游引物 ；上游 引 物 ，下游 引 物 。反应条件为：预变性 ，变性 及退火延伸 共 个循环。反应结束后，以 为内参基因，采用 法计算目的基因 相对表达量。统计学处理采用 软件进行统计分析。所有数据来源于个独立重复实验，计量数据用?表示，组间比较采用 检验。为差异有统计学意义。结果 不同浓度 加入后 细胞活力、组 细 胞 存 活 率 分 别 为 、。与 组比较，、组细胞存活率均降低，差异有统计学意义（分别为 、，均 ）。不同浓度 加入后 细胞凋亡情况与 组比较，、组 升高（分别为 、，均 ），、组 升高（分别为 、，均 ）、升高（分别为 、，均 ），升 高（分 别 为 、，均 ）。见表。表各组
7、 细胞 、表达比较（?）组别 组 组 组 组 组 注：与 组比较，。加 入 后 细 胞 活 力 、变化 与 组比较，在、组升高（分别为 、，均 ），预防医学论坛 年月第 卷第期 ，在、组升高（分别为 、，均 ），在 、组均升高（分别为 、，均 ）。见表。表各组 细胞 、表达比较（?）组别 组 组 组 组 组 注：与 组比较，。讨论 因对哺乳动物毒性较低而被广泛应用于农业和 家 庭 宠 物 的 昆 虫 防 治。但 近 年 研 究 表 明，不仅选择性作用于昆虫 ，还可与哺乳动物 结合，而哺乳动物 在神经系统和生殖系统（如睾丸间质细胞、支持细胞、精原细胞、胎盘等）中均有表达。因此，暴露可能导致人类及
8、哺乳动物的生殖功能损害。目前，暴露致生殖毒性主要利用动物模型进行研究，但相关机制并不明确。因此，本研究在体外利用 细胞，探究 对生殖细胞的毒性作用及其可能机制。我们在前期研究中探索了 处理 细胞 时的 ，为 ，此剂量较高，可能是由于母体化合物 对 毒性较低，而其代谢产物去甲基啶虫脒发挥主要毒性作用，这有待进一步研究。根据前期的研究结果，本研究 暴露剂量选择为、。细胞活力检测结果发现，细胞活力随 浓度升高而降低，表明 暴露可导致 细胞损伤。但对细胞凋亡相关基因检测发现，、作用后，细胞 显著上调，、作用后 细胞 上调，表明低剂量 暴露可促进 细胞凋亡，而高剂量 暴露则抑制 细胞凋亡。、和 蛋白共同
9、参与调控细胞凋亡，和 比值决定了细胞凋亡的走向，两者可作为 的上游调控因子，过表 达 可 抑 制 的 转 位 和 二 聚 体 化，进 而 抑 制 的激活，发挥抗凋亡作用。因此，低剂量 暴露激活 ，导致了 级联反应，促进凋亡；而高剂量 暴露可能导致了 细胞中抗凋亡通路的激活，使 表达上调，从而发挥了与低剂量不同的抗凋亡作用。这也说明了 具有非单调剂量效应。据此推测，降低细胞活力可能不是通过促进细胞凋亡引起的，其可能是通过影响细胞周期导致细胞活力降低，相关机制仍在研究中。关于 暴露致生殖细胞凋亡的动物实验研究也有报道。等 以 、（）染毒雄性大鼠，发现睾丸中精子浓度和血浆睾酮水平呈剂量依赖性下降，、
10、剂量组睾丸 组 织 细 胞 凋亡 率显 著增 加。而 关 于 另 一 种 噻虫胺 的 研 究 发 现，小 鼠 孕 期 和 哺 乳 期（）噻虫胺暴露、（）可导致雄性子代精子数量降低，但不影响睾丸组织细胞凋亡数量和增殖活性。本研究与体内研究结果的不一致可能是由于 在体内可代谢为去甲基啶虫脒，该代谢产物可能在 致生殖毒性中发挥重要作用，并且其在体内中表现出比 更高的检出率和检测水平。但目前，及其代谢产物对睾丸组织细胞凋亡影响的相关研究较少，还需更多研究明确。信号通路在细胞凋亡调控中发挥重要作用。激活，可使 磷酸化，磷酸化的 与抗凋亡结合蛋白 结合，促进 表达，发挥抗细胞凋亡作用；也可以使 失活，抑制
11、细胞凋亡，。在各组织器官（包括心、肝、肾、睾丸、卵巢、胎盘等）广泛表达。激活，可磷酸化细胞质内的 ，使其不能进入细胞核内诱导凋亡相关因子的转录，从而发挥抗凋亡作用，。本研究发现，处理可导致 、表达上调，表明 可激活 信号通路。这也进一步说明高剂量 可能通过激活 信号通路，抑制 细胞凋亡，而低剂量 暴露时，激活 ，促凋亡作用更为显著。但目前尚未见 对哺乳动物睾丸组织 信号通路影响的体内外研究报道，因此还需深入研究以明确 对该通路的影响。综上所述，可导致 细胞活力降低，剂量越高作用越强；低剂量 可促进 细胞凋亡、高剂量 可抑制细胞凋亡；高剂量 可能通过调控 信号通路发挥抗凋亡作用。本研究还需进一步
12、对相关基因的蛋白表达水平进行检测，以明确 对 信号通路和细胞凋亡的影响。参考文献，预防医学论坛 年月第 卷第期 ，：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）（）（），（）：，（）：，（）：，：，：，（）：潘蓉蓉，金永喜，朱文宗 信号通路介导的细胞凋亡机制研究进展 ，（）：，（）：，：作者贡献声明：刘芙：细胞实验，指标检测，撰写论文；王鑫，袁宁：指标监测，原始结果收集、整理与分析；马跃：数据统计分析；马明月：指导研究方案设计及可行性分析，审核论文；毛亚萍：提出研究思路和研究方案，审核并修订论文。收稿日期：本文编辑：韩磊读者作者编者 预防医学论坛 启用“作者贡献声明”为明确论
13、文作者对学术研究及论文的具体贡献与责任，防范不当署名、署名纠纷等学术不端问题，并引导作者负责任署名行为，本刊加强对作者署名的规范要求，自 年始启用作者贡献声明。作者向本刊投稿时需在论文文末列出每位作者的实质性学术贡献，本刊自 年第 卷第期始将对发表的论文于其文末公布作者贡献声明。作者对学术研究及论文的实质性学术贡献，总体而言需包括但不限于以下工作：为研究工作的概念、思路、选题、设计、实施及数据的获取、分析或解释做出重要贡献；撰写论文或对其关键内容进行修改；对最终发表的论文进行全面审核与把关，并作最终定稿；同意对研究工作各个方面负责，保证对论文任何部分的准确性或科研诚信问题进行调查和解决。除具备以上实质性学术贡献外，作者署名还需同时满足以下条件：了解全部研究过程；了解论文全文内容，认可付诸发表的论文最终版本的内容，包括本人和其他全部作者贡献的表述；同意署名，认可署名角色和顺序；同意承担署名责任。预防医学论坛 编辑部 年月预防医学论坛 年月第 卷第期 ，