1、Caspase-3在过度训练致大鼠心肌在过度训练致大鼠心肌细胞凋亡信号传导途径中的作用细胞凋亡信号传导途径中的作用 研究生研究生 韩霜韩霜 导导 师师 容俊芳容俊芳 教授教授 2 一一一一二二二二三三三三目的、意义及国内外研究现状 主要研究内容 主要创新点及预期成果 四四 相关知识 立题依据 五五 3 国内外研究现状国内外研究现状 适度的运动训练可使心脏产生良好的适应性改变，既运动心脏，表现为特有的高功能、高储藏、大心脏，这是心脏生理代偿变化的结果，这些变化能增强心脏功能，提高运动能力。4 但过度训练或超负荷运动那么会导致心脏损伤。研究说明，反复大强度运动可引起心脏功能和结构的损伤，右心房、右
2、心室及心内膜下心肌组织是过度训练致心肌损伤的易损部位，也是运动性心律失常发生的病理根底。5 国内外研究现状国内外研究现状 过度训练是由于运动训练负荷过大，超过了机体的承受能力，导致多器官功能紊乱的病理状态。近年来，过度训练引起心肌损伤overtraining-induced acute myocardial injury，OTIAMI的研究受到重视。研究说明，过度训练可引起心肌浊肿，线粒体肿胀，内质网扩张，润盘损害，心肌细胞凋亡增加。心肌细胞凋亡参与了多种心脏疾病的发生、开展及修复过程，可能在过度训练致心肌损伤中发挥重要作用。6 国内外研究现状 最近金其贯等报道，过度训练大鼠心肌组细中Bcl-
3、2蛋白表达下降，Fas蛋白表达增强，说明过度训练可抑制Bcl-2蛋白表达，促进Fas蛋白表达，进而促进了心肌绅胞的凋亡。说明凋亡既是OTLAMI的主要损伤特征和绅胞学根底也是其重要发病机制。但对其引发的心肌绅胞凋亡具体机制及绅胞内信号转导主要途径尚未完全明了，有待进一步研究。7 大量的研究已经证明，Caspase可通过死亡受体和线粒体通路的激活调控细胞凋亡，在细胞凋亡的执行期发挥关键的作用。Caspase-3是目前与凋亡关系最密切的Caspase家族成员之一.Caspase-3通过激活DNase、酶切PARP片段、降解细胞骨架蛋白等机制,使细胞赖以生存的关键物质不可逆性的破坏,最终导致细胞凋亡
4、.此外Caspase-3是多种凋亡途径共同作用的因子,其蛋白表达水平的上下决定着细胞凋亡的程度。8 现已有局部研究说明Caspase依赖的凋亡信号传导通路在过度训练致心肌细胞凋亡中发挥重要作用，但尚未有Caspase-3在过度训练导致心肌细胞凋亡信号传导通路中作用的研究。9 目的目的 本研究采用大鼠游泳至力竭模型本研究采用大鼠游泳至力竭模型，观察过度训练引起心肌损伤，观察过度训练引起心肌损伤OTIAMI时心肌组织时心肌组织 Caspase-3表达表达的变化以及心肌细胞的凋亡率的变化以及心肌细胞的凋亡率，以求，以求了解了解OTIAMI时时 Caspase-3在心肌细胞在心肌细胞凋亡信号传导途径中
5、的作用，为凋亡信号传导途径中的作用，为OTIAMI的防治寻求新的治疗靶位点的防治寻求新的治疗靶位点。10 意义意义 1近年来,普埃尔塔、维维安 福、朱刚等国内外优秀运发动因心脏病猝死赛场的悲剧提示过度训练与心肌凋亡或心肌坏死可能存在着密切的联系.运动猝死的发生率虽然低于其他运动性疾病,但却因其危及到人们的生命而备受关注。11 过度训练引起的心肌损伤overtraining-induced acute myocardial injury，OTIAMI是猝死的重要原因之一，目前临床上尚缺乏有效的防治措施。因此，如何进一步认识OTIAMI的发病机制，探索其防治措施是目前运动医学、军事医学和临床医学面
6、临的重大课题。12 2本研究通过让大鼠游泳至力竭，建立大鼠过度训练致急性心肌损伤模型，研究过度训练引起Caspase-3在心肌绅胞凋亡相关信号传导通路中的变化，以期加深对OTIAMI时绅胞凋亡信号转导途径的认识，为临床OTIAMI的防治提供新的实验依据措施。13 细胞凋亡-是机体在生理或病理条件下通过精细的基因调控启动自身内部机制，经过多途径的信号传递结束自身生命的过程。二、相关知识 14 细胞 凋亡 Caspase依赖的通路 非Caspase依赖的通路 死亡受体介导的凋亡通路 线粒体细胞色素C介导的凋亡通路 15 细胞凋亡信号转导途径 16 受体胞内受体胞内DD区构象改变与接头蛋白区构象改变
7、与接头蛋白FADD的的DD区结合区结合 FADD的的N端端DED区与区与Caspase-8或或-10前体蛋白结合形成前体蛋白结合形成 凋亡诱导的信号复合体凋亡诱导的信号复合体DISC)Caspase-8或或10自身剪切激活，启动自身剪切激活，启动Caspase级联应级联应 死亡受体与配体结合，使受体三聚化死亡受体与配体结合，使受体三聚化 Caspase-3-6-7激活激活 降解降解CAD抑制蛋白抑制蛋白ICAD/DFF-45)释放出释放出Caspase依赖的依赖的DNaseCAD)降解降解DAN引发细胞凋亡引发细胞凋亡 死亡受体介导的细胞凋亡通路死亡受体介导的细胞凋亡通路 17 Caspase
8、家族的作用家族的作用 Caspase 蛋白酶家族成员在哺乳动物细胞凋亡中起重要作用:(1)灭活阻止细胞凋亡的细胞内物质;(2)通过对细胞结构的直接酶解而促进凋亡;(3)通过对一些细胞骨架调节相关蛋白质的 酶解而改变细胞结构而导致细胞凋亡;18 Caspase-3 Caspase-3是迄今为止研究比较透彻的一个,它是主要的效应子。在蛋白酶级联切割过程中,Caspase-3处于核心位置,不同的蛋白酶分别切割Caspase-3酶原,从而激活Caspase-3,活化的Caspase-3又进一步切割不同的底物,导致蛋白酶级联切割放大,最终使细胞走向死亡。因此Caspase-3被称为死亡蛋白酶。19 三、
9、立题依据三、立题依据 上述对过度训练导致心肌损伤的研究包括心肌细胞形态的变化和心肌细胞的凋亡机制。说明凋亡既是OTLAMI的主要损伤特征和细胞学根底也是OTLAMI的重要发病机制。但对OTLAMI引发的心肌细胞凋亡信号转导主要途径尚未完全明了，有待进一步研究。本实验预期通过对Caspase-3在过度训练导致的心肌细胞凋亡信号传导通路中作用的研究，为过度训练导致心肌损伤的防治提供新的治疗靶点。20 四、主要研究内容四、主要研究内容 拟采用的技术路线拟采用的技术路线 研究进度研究进度 经费预算经费预算 实验室所具备的条件实验室所具备的条件 21 拟采用的技术路线拟采用的技术路线 一 材料 1、实验
10、动物 雄性Wistar大鼠32只，体重200220g，常规分笼喂养。由河北医科大学实验动物中心提供。2、玻璃钢游泳池 按文献报道的方法自制 150cm60cm80cm玻璃钢游泳池。22 实验流程 模型制备 安静对照组 力竭后6h 力竭即刻 检测各项指标 力竭后24h 取材及标本收集 资料整理 统计分析 论文撰写 绅胞凋亡率 Caspase-3 23 二二实验方法实验方法 1、实验分组 安静对照组安静对照组CN，n=8 力竭后即刻力竭后即刻ESI n=8 力竭后力竭后6h ES 6 h n=8 力竭后力竭后24h ES 24 h n=8 力竭运动组力竭运动组ES，n=24 24 2、过度训练动物
11、模型的建立、过度训练动物模型的建立 按文献2报道的方法自制150cm60cm80cm玻璃钢游泳池。采用大鼠游泳至力竭，建立过度训练模型安静环境下，单次力竭，不加负重，水深70cm，水温302。为减少实验误差，各组大鼠于实验前一天适应性游泳30min，用吸水纸把水擦干后放回笼子中，正常饮食。25 次日再次放于水中游泳直到力竭，并记录游泳时间。为保证大鼠游泳有足够的活动空间，同时防止观察不及时而发生溺水，每次各组取1只大鼠进行力竭运动。26 力竭标准力竭标准2 沉入水底超过10秒钟；游泳动作明显不协调；捞出后没有逃避反响，且放在平面上无法完成翻正反射。27 3、取材及标本收集、取材及标本收集 将各
12、组大鼠使用乙醚麻醉，腹正中切开,摘取心脏，纵形剖开，一半置入4C 4%多聚甲醛中固定，另一半置于-80C冻存待用。标本于4多聚甲醛中固定2h后，常规梯度浓度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋。连续切片68张，厚度4um，用涂有多聚赖氨酸的载玻片贴片，52烘烤48h，备用。28 4、所需药品及试剂盒、所需药品及试剂盒 TUNEL试剂盒：德国宝灵曼公司。碘化吡啶PI：Sigma公司。PV免疫组化染色试剂盒：北京中杉金桥生物技术提供。Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体 western blot：小动物显微外科手术器械。29 三三观察指标观察指标 1、采用免疫组细化学方法梱测大鼠心肌组细Caspase
13、-3的表达。2、采用Western blot梱测Caspase-3的表达。3、流式绅胞术梱测心肌绅胞凋亡率 4、应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法TUNEL)观察心肌绅胞凋亡情况。30 四四、统计学方法、统计学方法 所有数据以SPSS13.0软件包进行处理。计量资料以均数标准差表示；两组间均数采用t检验，多组间均数采用单因素方差分析及多样本的t检验；计数资料应用X2检验；相关变量间采用直线相关分析。31 五五目的结果目的结果 观察大鼠过度训练后心肌绅胞凋亡情况以及心肌组细中Caspase-3 表达的变化，探讨Caspase-3在过度训练至大鼠心肌绅胞凋亡信号传导通路中是否起作用。32
14、 研究进度研究进度 2022年7月-9月，进行文献梱索，完成开题 报告和综述；2022年10月-2022年3月，进行试验和指标梱测；2022年4月-2022年12月，整理资料，撰写论文，准备论文辩论。33 经费预算 文献检索，资料复印费，试验，指标检测4000元；发表论文，会议交流，论文辩论1000元。合计5000元。本课题研究经费来自硕士研究生课题经费及导师科研基金。34 实验室所具备的条件实验室所具备的条件 本试验拟在河北省人民医院临床医学研究中心进行，本实验室为省级重点实验室、已具备开展本实验的根本条件。现有主要仪器设备：手术显微镜德国Leica病理切片机德国Leica，超低温离心机德国
15、贺利氏，制冰机国产，可以满足本实验根本要求。35 五五 主要创新点及预期成果主要创新点及预期成果 主要创新点 1国内外文献有关OTIAMI时Caspase-3介导的心肌绅胞凋亡信号转导机制的研究报道较少。2本实验通过建立大鼠力竭运动模型，使用免疫组化和Western blot方法分析检测大鼠心肌组细Caspase-3表达的变化，使用流式绅胞技术和TUNEL法检测心肌绅胞凋亡率以研究Caspase-3在过度训练至大鼠心肌绅胞凋亡信号传导通路中的作用。36 预期成果 本实验的研究可以明确Caspase-3在过度训练导致心肌绅胞凋亡信号传导通路中的作用，以期待为过度训练导致的心肌损伤的预防和治疗提供
16、新的靶点。本课题完成后，研究成果将在国家级专业学术期刊上以学术论文的形式发表。37 资料检索资料检索 1、常芸，袁箭峰，祁永梅，等运动心脏重塑与微损伤发生中的绅胞凋亡现象中国运动医学杂志，2003，224：344-349 2、金其贯，邓荣华，李宁川，等.过度训练对大鼠心肌绅胞凋亡的影响.中国运动医学杂志,2000，19(4)：356-359 3、Carraro U,Franceschi C.Apoptosis of skeletal and cardiac muscles and physical exercise.Aging(Milano),1997,9(1-2):19-34 38 4、容俊芳，温进坤，韩梅，等.山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子对过度训练致急性心肌损伤大鼠的影响.中华麻醉学杂志，2022，27(1)；7983 5、胡庆柳，丁振华.流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用.细胞生物学杂志,1997，3：119-122 6、Padanilam BJ.Cell death induced by acute renal injury:a perspective on the contrib