1、文章编号:1009-6094(2023)02-0603-08多环芳烃光动力降解产物的细胞毒性检验*武娟1，智锦锦2，刘珊1，卢娜2，刘利1，高江明1，薛长湖2，唐庆娟2(1 青岛海洋生物医药研究院新药筛选与评价中心，山东青岛 266100;2 中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003)摘要:对多环芳烃的光动力降解产物进行细胞毒性评价，将 8 种多环芳烃(菲、蒽、萘、荧蒽、苯并 a 芘、苯并 k 荧蒽和苯并 a 蒽)水溶液分为对照组和光动力试验组，分别与小鼠成纤维细胞 L929 细胞系共培养一段时间，通过倒置显微镜观察细胞形态的变化，磺酰罗丹明 B 试验计算细胞存活率，根据细胞核染
2、色和 Annexin VFITC/PI 染色配合流式细胞仪分析细胞凋亡情况来综合评价多环芳烃的光动力降解产物的细胞毒性。结果表明:经倒置显微镜观察，光动力试验组的死细胞数量变少;在 25.0 ng/mL、12.5 ng/mL、3.1ng/mL 和 1.6 ng/mL 下，细胞存活率较之对照组分别增高了21.35%、20.22%、20.22%和 20.23%;经细胞核染色发现，在 50.0 ng/mL 和 25.0 ng/mL 下，光动力试验组的细胞凋亡率分别为 40%和 14%，较之对照组明显降低;经 Annexin VFITC/PI 染色及流式细胞仪分析，在 50.0 ng/mL 下，光动力
3、试验组的细胞凋亡率比对照组降低了 32.67%。试验结果证实了多环芳烃的光动力降解产物较之未降解的多环芳烃的细胞毒性降低。关键词:环境工程学;多环芳烃;光动力;降解产物;细胞毒性中图分类号:X52文献标志码:ADOI:10.13637/j issn 1009-6094.2021.1908*收稿日期:20211101作者简介:武娟，工程师，硕士，从事食品安全与营养研究;唐庆娟(通信作者)，教授，博士，从事水产品质 量 控 制 新 技 术 和 分 子 营 养 学 研 究，tangqingjuan ouc edu cn。基金项目:国家重点研发计划项目(2019YFC1604605)0引言多环 芳 烃
4、(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是指多个(两个或两个以上)苯环以稠环形式相连的化合物1，可在有机化合物不完全燃烧和地球化学过程中产生，是重要的环境和食品有机污染物2 3。近年来，各种矿物燃料(如煤、石油和天然气等)、木材、纸以及其他含碳氢化合物的不完全燃烧、工业污水的排放，以及海上石油泄漏等所产生的大量多环芳烃汇入江河湖泊和地下水，进一步污染食用水体和养殖水体，通过食物链向人体转移，最终富集到人体中，严重威胁着人类的健康4 6。对水源污染的控制已成为近年来人们关注的焦点，对水体中有机污染物(如多环芳烃)的处理方式主要有化学、物理和生物降解法，然而，
5、这些传统的处理方法仍有一定的局限性7 8，例如高投资、高成本、难操作。另外，有些处理方法在实施过程中会释放次级副产物，造成二次污染，甚至是致癌、致突变的化合物，对食用水体和养殖水体的净化具有一定的局限性9 10。1991 年，王连生等11 首次报道了17 种多环芳烃在水溶液中的光解，表明大部分PAHs 光解为光氧化反应。本课题组在光降解多环芳烃的基础上进行探索，发现了光动力降解多环芳烃技术，可以实现快速有效地降解水体及牡蛎中的8 种多环芳烃，该技术与光降解相比所需时间短且降解效率高12 14，在光照 15 min 时水体中 8 种多环芳烃降解率达到 90%以上，富集于牡蛎中的多环芳烃降解率达到
6、 21.92%88.46%。为了将该技术在生产生活用水及养殖水体中推广应用，考虑到多环芳烃在降解过程中可能会产生毒性更大的中间体或产物，因此，需要进一步评价中间产物的安全性。目前对毒性检测的方法包括体外和体内检测法，体内检测法主要有试验动物(大鼠、家兔、狗、猴等)和人体试验，体外检测法主要有细胞毒性检测法、色谱法、水生生物检测法等15 18。目前，对多环芳烃的降解产物毒性评价主要是采用发光细菌进行生物毒性评价15，19。细胞毒性评价通过直接观察受试物对细胞的作用反映其毒理学本质特征，通过细胞毒性评价可以在其他体外毒性评价试验系统和整体动物系统之前起到填补差距的桥梁作用。已有研究报道，光敏化姜黄
7、素对 L929 细胞没有细胞毒性20。但姜黄素介导的光动力降解多环芳烃后，中间体或产物的细胞毒性评价尚未见报道。本研究采用食品领域应用较广泛的细胞毒性检测法21 22，来评价水体中 8 种多环芳烃经姜黄素介导的光动力降解后，其产物的细胞毒性，旨在为其进一步安全性评价以及光动力技术在养殖水体和生产生活用水中多环芳烃降解的应用提供理论依据。1材料与方法1.1试剂与仪器多环芳烃的混合标准溶液(菲、蒽、萘、荧蒽、306第 23 卷第 2 期2023 年 2 月安全 与 环 境 学 报Journal of Safety and EnvironmentVol 23No 2Feb，2023苯并 a芘、苯并
8、k荧蒽和苯并 a蒽，质量浓度200 g/mL)，北京嘉世玉禾化工技术研究院;小鼠成纤维细胞 L929 细胞系，中国科学院上海细胞库;DMEM 高糖培养液、新生牛血清 NBCS、青霉素 链霉素双 抗 溶 液，美 国 Hyclone 公 司;0.25%胰 酶EDTA，浙江森瑞生物科技有限公司;Hoechst 33258染色试 剂 盒，上 海 碧 云 天 生 物 技 术 有 限 公 司;Annexin VFITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒，杭州联科生物技术股份有限公司;磺酰罗丹明 B(SRB)，美国 Sigma 公司;PBS 袋装预混试剂，北京康为世纪生物科技有限公司;6 孔板和 96 孔板，生工生
9、物工程(上海)股份有限公司;0.22 m 无菌针式滤器，北京硕华佰奥生物科技有限公司;血球计数板，上海求精生化试剂仪器有限公司;其他生化试剂均为国产分析纯。倒置显微镜，日本 Olympus 公司;多功能酶标仪，美国 Molecular Devices 公司;流式细胞仪，美国BD 公司;荧光显微镜，尼康仪器(上海)有限公司。1.2试验方法1.2.1L929 细胞培养小鼠成纤维细胞 L929 细胞系置于含 10%新生牛血清、100 U/mL 青霉素和100 g/mL 链霉素混合液的 DMEM 高糖培养液中，于37、5%CO2的细胞培养箱中培养，换液 1 次/2 d，细胞达到 80%90%融合后，消
10、化并传代20。1.2.2样品的制备及浓度设置多环芳烃样品由食品科学与人类健康试验室制备，分为对照组和光动力试验组。对照组和光动力试验组质量浓度设置为 50.0 ng/mL、25.0 ng/mL、12.5 ng/mL、6.3 ng/mL、3.1 ng/mL、1.6 ng/mL。样品经 0.22 m 无菌针式滤器过滤后待用。PAHs 乙腈储备液:将 250 L 质量浓度为 200g/mL 的 PAHs 混合标准溶液用 50 mL 乙腈稀释成质量浓度为 1 g/mL 的 PAHs 乙腈储备液。对照组溶液:取 PAHs 乙腈储备液 50 mL，用超纯水定容到 1 L，得到多环芳烃对照组溶液(质量浓度为
11、 50 ng/mL)。光动力试验组溶液:取一定量的姜黄素原液(姜黄素原液:用食用乙醇溶解，浓度为 20 mmol/L)，溶于上述多环芳烃对照溶液中，使姜黄素的终浓度为10 mol/L，在波长为 420 nm 光源下照射 15 min，得到多环芳烃光动力试验组溶液13。1.2.3样品与细胞共培养处于对数生长期的 L929 细胞，以 2 000 个/孔(细胞浓度为0.2 105个/mL，100 L/孔)接种于96孔板，设置 4 个复孔，在 5%CO2、37 细胞培养箱中贴壁生长 24 h。将不同质量浓度的多环芳烃对照组和试验组溶液添加到细胞培养液中，空白对照孔只添加含 10%新生牛血清的 DMEM
12、 培养基。5%CO2、37 细胞培养箱中培养，分别于 24 h、48 h 和72 h 于倒置显微镜下观察细胞形态。1.2.4磺酰罗丹明 B(SRB)试验分别于 24 h、48 h、72 h 各取出一块培养板，吸弃细胞上清。每孔加入 0.61 mol/L 的冷三氯乙酸(TCA)固定细胞，并以 SRB 染色后，加入 150 L/孔的 Tris 溶液，充分溶解细胞沉淀，于酶标仪上测定540 nm 处的 OD(吸光值)23 24，计算细胞存活率。1.2.5细胞核染色取普通洁净的盖玻片于 70%乙醇中浸泡至少 5min，用无菌 PBS 缓冲液洗涤三遍，再用完全培养液洗涤一遍。将盖玻片置于 6 孔板内，种
13、入 L929 细胞(细胞浓度为 5 105个/mL，2 mL/孔)，培养过夜。对照组和试验组溶液质量浓度设置同 1.2.3 节。细胞核染色方法及操作步骤参照文献 20。1.2.6流式细胞仪分析处于对数生长期的 L929 细胞，以 1 106个/孔(细胞浓度为 5 105个/mL，2 mL/孔)接种于 6 孔板中，培养过夜。将质量浓度为 50.0 ng/mL、25.0ng/mL、12.5 ng/mL 的多环芳烃对照组和试验组溶液添加到细胞上培养 72 h，空白对照孔只添加含10%新生牛血清的 DMEM 培养基。样品处理及检测方法参照 Annexin VFITC/PI 试剂盒说明书及文献 25。流
14、式细胞仪检测参数 FSCA、FSCH、SSCA、FITCA、PIA 电压设置分别为 111 V、111 V、273 V、337 V、352 V1.3数据分析试验结果以(Mean SD)表示，采用 GraphPadPrism 7.0 软件作图并进行单因素方差统计学分析(One-Way ANOVA)，以 p 0.05 表示差异有统计学意义。2结果与分析2.1多环芳烃经光动力处理后对 L929 细胞存活率的影响在 25.0 ng/mL、12.5 ng/mL、6.3 ng/mL、3.1ng/mL 下，试验组比对照组的死细胞(呈悬浮、皱缩、无细胞结构状)数明显变少，见图 1。统计分析结果显示，随着孵育时
15、间的延长，试验组与对照组的细胞406Vol 23No 2安全 与 环 境 学 报第 23 卷第 2 期箭头表示死细胞;圆圈表示无细胞区域图 1L929 细胞的形态观察(倒置显微镜 10)Fig 1Morphology of L929 cell under the inverted microscope(10)存活率差异越来越明显，孵育 48 h 后，25.0 ng/mL和 12.5 ng/mL 试验组细胞存活率较之对照组分别增高了 15.62%和 14.06%(p 0.01);孵育 72 h后，25.0 ng/mL、12.5 ng/mL、3.1 ng/mL 和 1.6ng/mL 试验组细胞存活
16、率较之对照组分别增高了21.35%、20.22%、20.22%和20.23%(p 0.01)，见图 2。以上试验结果表明，光动力处理后多环芳烃的降解产物比未处理的多环芳烃的毒性降低。2.2多环芳烃经光动力处理后对 L929 细胞凋亡的影响Hoechst33258 染色液是一种蓝色非嵌入性荧光染料，可以穿透细胞膜。细胞经染色后，正常细胞的细胞核在荧光显微镜下呈现饱满的淡蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染或呈碎块状致密浓染20。随着多环芳烃质量浓度的升高，对照组和试“”p 0.01，试验组与对照组同质量浓度下比较图 2多环芳烃经光动力处理后对 L929 细胞存活率的影响Fig 2Effect of 8 PAHs by photodynamic treatmenton L929 cell viability验组 的 细 胞 凋 亡 率 均 增 加，50.0 ng/mL、25.05062023 年2 月武娟，等:多环芳烃光动力降解产物的细胞毒性检验Feb，2023ng/mL、12.5 ng/mL 试验组的细胞存活数量比对照组明显增多，且在 50.0 ng/mL 和 25.0 ng/mL 对照