1、长春理工大学学报（自然科学版）Journal of Changchun University of Science and Technology（Natural Science Edition）Vol.46No.1Feb.2023第46卷第1期2023年2月江林霞，等：分离富集循环肿瘤细胞的三维介电泳微流控芯片研究收稿日期：2022-04-30基金项目：吉林省科技厅发展计划项目（20210204194YY）；吉林省教育厅科技项目（JJKH20210848KJ，JJKH20210850KJ，JJKH20210852KJ）作者简介：江林霞（1996-），女，硕士研究生，E-mail：通讯作者：金丽
2、虹（1978-），女，博士，副教授，硕士生导师，E-mail：分离富集循环肿瘤细胞的三维介电泳微流控芯片研究江林霞，梁风，金丽虹，申炳俊，侯利杰（长春理工大学生命科学技术学院，长春130022）摘要：进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞（CTCs），它是恶性肿瘤转移早期精准检测重要指标之一。基于介电泳原理进行了分离富集 CTCs 微流控芯片设计及性能研究，利用 CTCs 和白细胞受到的介电泳力差异及运动轨迹不同，实现 CTCs 分离富集。根据 COMSOL 软件仿真细胞运动轨迹，优化芯片结构，确定电极间距和通道高度。湿法刻蚀和激光烧蚀技术制作了芯片实物，以人结肠癌细胞 SW480 和人白细
3、胞混合液为研究对象，进行了芯片分离富集 CTCs 实验。在电压为 5 Vrms、频率为 60 kHz 时，三维介电泳微流控芯片对人结肠癌细胞 SW480 的最大分离通量达到 1.2 mL/h，分离效率在 90%左右。研究成果对于 CTCs 分离、分选以及检测等方面具有重要参考价值。关键词：循环肿瘤细胞；介电泳；微流控芯片；白细胞；分离中图分类号：TP751文献标志码：A文章编号：1672-9870（2023）01-0114-07Separating Chip Based on Three-DimensionalDielectrophoresis Circulating Tumor CellsJ
4、IANG Linxia，LIANG Feng，JIN Lihong，SHEN Bingjun，HOU Lijie（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）Abstract：Tumor cells that enter human peripheral blood are called circulating tumor cells（CTCs）.With the advancementof medicine，the importanc
5、e of CTCs has gradually emerged.Due to its great potential in precision therapy，how to isolateand enrich CTCs from blood has also become a new research hotspot.In this paper，a CTCs separation chip was designedbased on dielectrophoresis technology.The differences in the characteristics of cells were
6、used to separate leukocytes andCTCs in different directions in the chip.This paper firstly uses COMSOL software to simulate the cell trajectory，optimizethe chip structure，and determine the electrode spacing and channel height.Wet etching and laser ablation are used to makethe actual chip，and the mix
7、ture of leukocytes and CTCs cells is used to simulate the blood of cancer patients.CTCs wereadsorbed on the bottom electrode by positive dielectrophoresis force，and the two kinds of cells were separated.The resultsshow that when the voltage is 5 Vrms and the frequency is 60 kHz，the maximum separatio
8、n amount of human colon can-cer cell SW480 using this chip is 1.2 mL/h，and the separation efficiency is about 90%.The research results have importantreference value for the isolation and sorting of circulating tumor cells.Key words：circulating tumor cells；dielectrophoresis；microfluidic chip；leukocyt
9、es；separation恶性肿瘤是全球重大公共卫生问题，严重威胁人类健康1。现代医学研究表明，恶性肿瘤死亡率的 90%与肿瘤细胞转移有关。因此，行之有效的进行肿瘤转移早期精准检测，这对于恶性肿瘤患者有效治疗、提高生存期和降低死亡率具有重要意义，也是临床肿瘤诊断领域重要研究课题之一。早在 1896 年 Ashwort2就发现并提出循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs），但 CTCs 在肿瘤诊断、监测疗效和判断预后等方面的价值直到近些年才逐渐被人们所熟知。多项研究相继证实，在恶性肿瘤早期就有少量的CTCs 进入血液，外周血 CTCs 与肿瘤的转移有关。然而 1
10、mL 肿瘤转移病人的外周血中仅有 110个 CTCs，如何从数量众多的白细胞（106个）和红细胞（109个）中高通量和高效率地分离富集到CTCs，这是 CTCs 检测技术需要解决的关键问题之一。迄今为止，CTCs 检测技术大多是在分离富集的基础上进行鉴定。CTCs 分离富集技术主要有基于肿瘤细胞与正常细胞物理性质差异的物理方法3（如大小、变形性、密度和介电性），依赖于细胞膜表面的抗原与偶联在分离介质上的抗体相结合的生物化学方法4。介电泳（Dielectrophoresis，DEP）又称双向电泳，是指在非均匀电场中，微粒由于介电极化率的不同而产生的定向运动，最早由英国科学家 Pohl5于 195
11、1 年提出。和其他 CTCs 分选方法相比，DEP 不需要标记，对细胞损伤小，能够很好地保护细胞的生物特性，有利于细胞的后续研究。近年来，介电泳微流控芯片在 CTCs 分离富集方面所展现的诱人优势，引起了研究人员广泛关注6-11。Waheed 等人12利用矩形交指电极芯片成功地从血细胞中分离出了人乳腺癌细胞。Amico 等人13设计并制作了四电极微流控装置，在血液中分离出了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。Elita 等人14使用三维碳电极介质电泳芯片对人髓系白血病单核细胞 U937 和单核细胞 U937 分化的巨噬细胞进行了分离。与二维介电泳微流控芯片相比，三维芯片的电场覆盖范围更广、通道更高，能够
12、有效克服二维芯片通量不高和焦耳热过高等缺点，其富集分离 CTCs 效率更加高效。基于此，文中设计了一种锯齿形电极的三维介电泳微流控芯片，根据 COMSOL 软件仿真芯片分离富集 CTCs 和白细胞结果，优化芯片内电极数量、电极间距、通道高度和电压大小参数，以提高芯片分离富集 CTCs 效率及通量。利用湿法刻蚀和激光烧蚀技术制作三维介电泳微流控芯片，芯片分离富集白细胞中的结肠癌细胞 SW480来验证其性能。结果显示，芯片中的 CTCs 受到正介电泳力，吸附在底部电极上，白细胞受到负介电泳力，悬浮在电极上方随溶液流出。三维介电泳微流控芯片能够有效地进行 CTCs 分离富集，这对于 CTCs 检测提
13、供了有益参考。1实验部分1.1仪器与试剂KW-4A 型台式匀胶机（上海江莱仪器有限公司）；HP-2020 型恒温加热板（汉邦科技有限公司）；Ptimovert 型倒置显微镜（卡尔蔡司有限公司）；AFG-2225 型信号发生器（固纬电子（苏州）有限公司）；Delta326 型电导率仪（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；LSP01-1B 型注射泵（迪创电子科技有限公司）；HERAcell 150i 型细胞培养箱（赛默飞世尔科技公司）。氧化铟锡（Indium tin oxides，ITO）导电玻片（华南湘城科技有限公司）；DC184PDMS 交联剂（美国道康宁有限公司）；DC184PDMS 胶（
14、美国道康宁有限公司）；AZ5214E 光刻胶（德国默克有限公司）；AZ300MIF 显影液（德国默克有限公司）；AZ 剥离液（德国默克有限公司）；RPMI-1640 培养基（Life Technologies 有限公司）；新生牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；二甲基亚砜（北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司）；磷 酸 缓 冲 液（PBS，Sigma 公司）用超纯水配制成 0.01 mol/L；结肠癌细胞 SW480（上海素尔生物科技有限公司）；实验用水为 18 M/cm 超纯水，所用其他试剂均江林霞，等：分离富集循环肿瘤细胞的三维介电泳微流控芯片研究第1期115长春理工大学学报（自
15、然科学版）2023年为分析纯。1.2分离富集原理借助介电泳技术，利用细胞自身特性的不同使两种细胞在芯片内受到相反方向的介电泳力而分离开来。介电泳力（FDEP）是指微粒子在不均匀电场内因极化率不同而产生的一种定向运动。在正弦变化的电场中，FDEP表达式为：FDEP=2mr3RefCM()E2（1）式中，E 为电场强度；m为溶液的介电常数；为交流信号的角频率；r 为微粒子半径；fCM为克劳修斯-莫索提因子（Clausius-Mossotti 因子，CM 因子）15。fCM表达式为：fCM()=*p-*m*p+2*m（2）*p=p-jp（3）*m=m-jm（4）Re fCM()=Re()*p-*m*
16、p+*m=2(p-m)(p+2m)-(m-p)(2m+p)2(p+2m)2+(2m+p)2（5）其中，j=-1；Re fCM()为fCM()的实部，取值范围为-0.51；p为粒子的介电常数；*p和*m分别为粒子和溶液的复介电常数；m和p分别为溶液及粒子的电导率。介电泳力的方向和RefCM()正负有关。当RefCM()0时，微粒子受到正介电泳力，由 低 电 场 向 高 电 场 处 移 动；而RefCM()=0时，介电泳力为零，微粒子不受电场影响，此时的频率称为交叉频率。三维介电泳微流控芯片由盖板、矩形主通道和刻有锯齿状交指电极的底板三层结构组成，其中上盖板和底板均为 ITO 玻片，通道部分为PDMS 薄膜，样本液入口和出口位于芯片盖板左右两侧。施加电压在芯片内产生不均匀电场，CTCs 和白细胞特性有差异，在特定频率区间可使芯片内 CTCs 受到正介电泳力吸附在芯片底部电极上，白细胞受到负介电泳力而悬浮在电极上方主通道并随溶液流出芯片，最终实现 CTCs分离富集，芯片结构及分离原理如图 1 所示。图 1芯片结构和分离富集原理示意图1.3芯片分离富集 CTCs 模拟仿真及结构优化采用 COM