1、第 卷第期 草地学报 年 月 ：干旱和高温胁迫下紫花苜蓿 酶活性变化及其基因序列分析侯燕红，生小燕，韩博，姜华，何承刚（云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 ）摘要：紫花苜蓿（）是一种分布极其广泛的多年生优质豆科牧草，分析干热胁迫下其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（，）酶活性变化及 蛋白的生物信息学。本研究以 阿尔冈金 紫花苜蓿和云南德钦县野生紫花苜蓿为材料，测定其在干旱胁迫和高温胁迫下的 酶活性的变化，同时扩增了 基因，并对 蛋白进行了生物信息学分析和系统发育分析。结果表明，在胁迫第 酶活性达到峰值，两种胁迫下野生紫花苜蓿的酶活性基本高于 阿尔冈金 紫花苜蓿，两种紫花苜蓿 蛋白均为不稳定蛋白和亲
2、水性蛋白。干旱胁迫与高温胁迫都对紫花苜蓿 酶活性产生了较大的影响，且两种紫花苜蓿 氨基酸序列保守性均较高。本研究可为提高高温和干旱条件下紫花苜蓿的光合特性进而增加产量提供理论依据。关键词：紫花苜蓿；干旱和高温胁迫；生物信息学中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：，（），.，：；收稿日期：；修回日期：基金项目：云南省农业联合基金重点项目（）；云南省产业创新人才项目和国家自然基金（）资助作者简介：侯燕红（），女，汉族，云南石林人，硕士研究生，研究方向为牧草种质资源，：；通信作者 ，：；紫花苜蓿（）是一种适口性好，蛋白质含量高，营养价值全面，利用年限长，分布极其广泛的多年生优质豆科牧草。随
3、着全球气候变暖并伴随着降水量减少的形势不断加剧，高温和干旱已经成为制约紫花苜蓿生产的一个难题。在中国南方，紫花苜蓿生长主要受高温的限制，因此，突破高温限制是实现其在该地区的开发与利用的关键。同时，干旱也严重影响着苜蓿的产量和品质，研究表明干旱和高温在自然环境中通常会伴随出现，两者同时出现对植物生长和产量的危害比单独出现更大。光合作用是植物生长发育过程中极其重要的生理过程，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（第期侯燕红等：干旱和高温胁迫下紫花苜蓿 酶活性变化及其基因序列分析 ，）是植物光合作用的重要关键酶之一，其功能是催化磷酸烯醇式丙酮酸（，）和碳酸氢根离子的反应，生成草酰乙酸（，）和无机磷酸（，），这是植
4、物和景天酸代谢植物同化与固定 的重要步骤，是植物光合作用必不可少的一步。在高等植物、藻类、细菌中广泛存在，目前，基因相继在拟南芥（）、大豆（）、水稻（）、玉米（）、甘蔗（）等植物中得到鉴定。研究表明，参与了植物逆境胁迫的应答，关于这方面的研究近年来也有很多。丁在松等 研究转 基因水稻在不同程度干旱胁迫下的光合特性，发现 增强了干旱胁迫下水稻抵御强光胁迫的能力。等 研究发现，玉米在适度干旱条件下，基因过表达能使其水分利用率和干物质积累量增加。方立锋等 研究转 基因水稻苗期抗旱性，发现其抗氧化能力和渗透调节能力均高于对照。赵晋峰等 从谷子基因中筛选出个 基因，得出 基因广泛参与了谷子苗期非生物逆境
5、胁迫应答。张庆琛等 研究了强光胁迫下玉米 基因等对拟南芥光合特性的影响，发现强光处理下 转基因拟南芥的光合速率显著高于正常处理，进而获得较高的生物量。另外也有研究表明，植物在面对干旱、冷害、强光、盐和低磷等非生物逆境胁迫时 ，基因均能够被强烈诱导并表达，说明植物在面对非生物逆境胁迫时 在其中发挥着一定作用。当前，对于各种植物在逆境胁迫下的研究比较广泛，有关于紫花苜蓿在干热胁迫下 羧化酶和活化酶活性变化及其基因表达的研究，也有紫花苜蓿的耐盐基因、抗逆基因 等的研究，但是对于紫花苜蓿在干旱和高温胁迫下 基因的研究比较缺乏。因此，本研究以抗逆性均较强的 阿尔冈金紫花苜蓿和云南省德钦县野生紫花苜蓿为材
6、料，测定两者在高温胁迫和干旱胁迫下的 酶活性，并扩增了 基因，对 蛋白进行了生物信息学分析和系统发育分析，为提高高温和干旱条件下紫花苜蓿的生物产量提供理论依据。材料与方法 供试材料供试的个材料为采集于云南省迪庆州德钦县奔子栏乡干热河谷区的野生紫花苜蓿和引自加拿大的 阿尔冈金 紫花苜蓿，前者在云南干热河谷地区干热条件下能够繁衍后代，能较好适应类似云南迪庆的生态条件，具有较强的抗旱性，后者抗逆性强，适应性广。试验设计试验采用盆栽方式，每盆种植 粒均匀饱满的紫花苜蓿种子，放置于云南农业大学草业科学实习基地温室内，选取片叶期的幼嫩叶片存放于 冰箱中用于 的提取及 基因的扩增。每个品种随机选取生长 并且
7、长势一致的盆材料，每盆 株。其中盆进行干旱胁迫处理，将其置于室内并在常温（温度 ，湿度 ）下处理，开始处理后不再浇水；另外盆进行干热胁迫处理，将其放入人工气候箱，空气湿度设定为 ，白天温度为 保持，夜间温度为 保持。分别于胁迫处理前（对照）以及胁迫处理后第，以及复水（恢复为处理前的湿度和温度，并浇水至花盆底部有水溢出为止）后（在图表中用表示），取相同部位叶片经液氮处理后置于 冰箱中，用于 酶活性的测定（试验做了个技术重复，个生物学重复）。试验内容与方法 酶活性测定酶液提取和活性测定参照 等 的 方 法。（）提 取 液 制 备：（）；，；（）酶液提取：在预冷研钵中放入称好的 新鲜叶片后加入液氮迅
8、速研磨，随后加 预冷提取液，在冰浴中研磨至匀浆，、离心 ，取上清液保存于 条件下 备 用；（）酶 活 性 测 定：反 应 体 系 为 缓冲液（），酶提 取 液，（），苹果酸脱氢酶。反应液混匀，水浴 ，用 提取液启动反应，测定波长在 处的吸光度。酶活性计算公式如下：酶活性（）（酶）其中 为反应前后的差值，为反应体系总体积，草地学报第 卷（）为比色光程，为每微摩尔 在 处的 吸 光 度，表 示 每 固 定 有 被氧化，为测定时间，酶为酶液体积。计算结果单位为 。提取取叶期的紫花苜蓿 幼嫩叶，采用上海生工生物工程股份有限公司的 柱式植物基因组 抽提试剂盒提取紫花苜蓿的 。扩增在 （）上搜索已知紫花苜
9、蓿的 基因序列，利用网站（）进 行 引 物 设 计：（），（），引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反应总体积为，包括上下游引物各，预 混 液 ，模板 ，。扩增程序为 预变性 ；变性，复性，延伸，个循环，延伸 。产物回收及测序将经 琼脂糖凝胶电泳检测合格后的 扩增产物进行回收纯化并测序。数据处理数据统计和折线图采用 软件进行。采用单因素方差分析法对同一材料不同条件下的差异显著性（）进行分析，对不同材料同一处理条件之间显著性差异（和 ）作独立样本检验，单因素方差分析和独立样本检验均采用 软件进行。采用 软件将本试验的紫花苜蓿 基因核酸序列翻译成蛋白质并作多序列比对，利用 软件分析并预测紫花苜
10、蓿 蛋白的理化性质。在 网站上将测序结果进行比对后，用 软件对本研究的两个材料以及 网站上下载的鹰嘴豆（，）、紫 花 苜 蓿（，）、蒺藜苜蓿（，）和菜豆（，）个 蛋白序列间同源关系进行比较，构建系统发育树。结果与分析 高温胁迫下紫花苜蓿 酶活性变化两种紫花苜蓿 酶活性变化随胁迫时间的延长都呈现出先上升后下降、再上升再下降、复水后上升的趋势（图），在胁迫第 达到峰值，且显著高于其他处理（），此时野生紫花苜蓿的 酶活性是胁迫前的 倍，阿尔冈金 紫花苜蓿是胁迫前的 倍；两种紫花苜蓿 酶活性在复水后均显著高于胁迫结束时（）。野生紫花苜蓿 酶活性在胁迫第、和复水后极显著高于相同条件下的 阿尔冈金 紫花苜
11、蓿（），在胁迫第 和 显著高于 阿尔冈金 紫花苜蓿（），其他条件下两种紫花苜蓿 酶活性之间均无显著差异。图高温胁迫下紫花苜蓿 酶活性变化 注：大写字母表示野生紫花苜蓿各项处理间的差异显著性（），小写字母表示 阿尔冈金 紫花苜蓿各项处理间的差异显著性（）；和 分别表示在相同条件下不同材料之间在 和 水平存在显著性差异，下同 ：（），（），第期侯燕红等：干旱和高温胁迫下紫花苜蓿 酶活性变化及其基因序列分析 干旱胁迫下紫花苜蓿 酶活性变化野生紫花苜蓿 酶活性变化随胁迫时间的延长呈现先上升、后下降、复水后上升的趋势，而 阿尔冈金 紫花苜蓿呈现先上升后下降、再上升再下降、复水后上升的趋势（图）；两种紫花
12、苜蓿均在在胁迫第 达到峰值，且显著高于其他处理（），此时野生紫花苜蓿的 酶活性是胁迫前的 倍，阿尔冈金 紫花苜蓿是胁迫前的 倍；两种紫花苜蓿 酶活性在复水后均显著高于胁迫结束时（）。野生紫花苜蓿 酶活性在胁迫第，和复水后极显著高于相同条件下的 阿尔冈金 紫花苜蓿（），在胁迫第和 显著高于 阿尔冈金紫花苜蓿（），其他条件下两种紫花苜蓿 酶活性之间均无显著差异。图干旱胁迫下紫花苜蓿 酶活性变化 紫花苜蓿 基因 扩增结果两种紫花苜蓿 基因 扩增产物电泳检测（图）均得到一条清晰明亮的条带。野生紫花苜蓿和 阿尔冈金 紫花苜蓿扩增序列长度分别为 和 ，且两份材料的序列均与 中紫花苜蓿 基因序列（）相似率为
13、 ，与蒺藜苜蓿 基因序列（）相似率为 。结果表明，获得的两份紫花苜蓿材料的目的片段均属于 基因家族。紫花苜蓿 蛋白理化性质表可以看出，野生紫花苜蓿和 阿尔冈金 紫花苜蓿的分子量分别为 和 ，氨基酸总数分别为 和 ；理论等电点均大于，为带正电荷蛋白；蛋白质不稳定指数均大于，均属于不稳定蛋白；亲水性平均系数均为负数，预测均为亲水性蛋白。图两种紫花苜蓿 基因 电泳图 注：，阿尔冈金 紫花苜蓿；，野生紫花苜蓿 ：，；，草地学报第 卷表两种紫花苜蓿 蛋白理化性质 参数 野生紫花苜蓿 阿尔冈金 紫花苜蓿 分子量 理论等电点 氨基酸总数 含量最丰富的氨基酸及数量 （），（），（）（），（），（）酸性氨基酸数
14、 碱性氨基酸数 亲水性平均系数 蛋白质不稳定指数 紫花苜蓿 基因遗传距离分析紫花苜蓿 蛋白同源性分析结果显示（表），野生紫花苜蓿和蒺藜苜蓿与紫花苜蓿之间，以及紫花苜蓿和蒺藜苜蓿之间同源性较高，均为；阿尔冈金 紫花苜蓿与野生紫花苜蓿、紫花苜蓿和蒺藜苜蓿之间一致性均大于；菜豆与其他个近缘种间相似性较低，均小于。表紫花苜蓿个近缘种间 蛋白同源性分析 阿尔冈金紫花苜蓿 野生紫花苜蓿 鹰嘴豆紫花苜蓿 蒺藜苜蓿 菜豆 注：左下为相似系数，右上为遗传距离 ：，紫花苜蓿 基因系统发育分析对野生紫花苜蓿、阿尔冈金 紫花苜蓿及个 基因近缘种间转录蛋白同源关系进行比较，结果显示（图）：野生紫花苜蓿、紫花苜蓿和蒺藜苜
15、蓿以 的支持率聚为一组，这一组与 阿尔冈金 紫花苜蓿聚为一支，支持率为；四种苜蓿与鹰嘴豆的同源关系为，而与菜豆同源关系最远，其关系距离为。图紫花苜蓿个近缘种的 蛋白同源关系树 讨论 酶不同程度地增强了植物抵御和适应外界胁迫的能力，帮助植物适应生物胁迫和非生物胁迫，同时，植物的 酶活性在外界胁迫下可增强 。本研究中，两种紫花苜蓿 酶活性随第期侯燕红等：干旱和高温胁迫下紫花苜蓿 酶活性变化及其基因序列分析着胁迫时间的延长，大致呈先增加后降低的趋势，当植物感应到胁迫时，会启动胁迫应激机制来抵御和适应外来影响。两种胁迫条件下，两种紫花苜蓿均在胁迫第 出现峰值，可能是此时达到了紫花苜蓿自我调节所能承受的
16、极限，酶活性在此之后则表现出下降的趋势，当受胁迫的紫花苜蓿未到死亡极限时给予复水，紫花苜蓿植株受到的胁迫减轻并脱离胁迫临界点后，酶活性又开始增强以便应对胁迫。在相同处理条件下，阿尔冈金紫花苜蓿的 酶活性基本上都低于野生紫花苜蓿，可能因为野生紫花苜蓿原本就生长在干热河谷极端恶劣的自然环境中，已经适应了干热环境下形成的特殊自我保护机制。两种胁迫条件下在复水前均可观察到一个滞缓期，表明紫花苜蓿 酶对植株复水的反应是一个长期反应，这可能与基因表达强度的减弱有关。两种紫花苜蓿 酶活性在复水后可完全恢复到胁迫前的水平，甚至高于胁迫前的水平，这说明植物 酶对植物的作用是一个可逆过程，这与雷明月等 的研究结果一致。本试验获得的野生紫花苜蓿和 阿尔冈金 紫花苜蓿的 核酸序列长度分别为 和 ，分别编码 和 个氨基酸，在氨基酸序列比对中，两种不同紫花苜蓿 基因氨基酸序列极度保守，具有高度的一致性，这与赵晋锋等 的研究结果一致。两种紫花苜蓿 蛋白的分子量、等电点、亲水系数和蛋白质不稳定系数等理化性质比较稳定，与在水稻、大豆 和油菜（）等植物上的研究结论相似。两个紫花苜蓿材料与个近缘种间 蛋白同源性分析中，野生