1、论论著著文文章章编编号号：（）干干扰扰 抑抑制制氧氧糖糖剥剥夺夺 复复氧氧诱诱导导的的大大鼠鼠 心心肌肌细细胞胞线线粒粒体体融融合合与与分分裂裂熊熊霞霞霞霞，熊熊卫卫平平，李李林林沅沅，杜杜娟娟，王王道道庄庄，王王旭旭（四四川川省省妇妇幼幼保保健健院院 ，四四川川 成成都都 ；四四川川省省妇妇幼幼保保健健院院儿儿童童心心脏脏中中心心，四四川川 成成都都 ；四四川川省省人人民民医医院院心心胸胸外外科科，四四川川 成成都都 ；北北京京阜阜外外心心血血管管病病医医院院小小儿儿心心脏脏中中心心，北北京京 ）收收稿稿日日期期：；接接受受日日期期：基基金金项项目目：四四川川省省科科技技厅厅课课题题（）作作
2、者者简简介介：熊熊霞霞霞霞（），女女，湖湖北北孝孝感感人人，副副主主任任医医师师，硕硕士士 ：；：通通讯讯作作者者，熊熊卫卫平平，：摘摘 要要 目目的的 探探讨讨干干扰扰 对对氧氧糖糖剥剥夺夺 复复氧氧（）诱诱导导的的心心肌肌细细胞胞线线粒粒体体融融合合与与分分裂裂的的影影响响。方方法法 将将 细细胞胞分分为为正正常常对对照照组组、模模型型组组、阴阴性性对对照照组组和和 干干扰扰组组。采采用用 法法诱诱导导大大鼠鼠 心心肌肌细细胞胞损损伤伤模模型型，阴阴性性对对照照组组细细胞胞转转染染 ，干干扰扰组组转转染染 ，正正常常对对照照组组细细胞胞不不转转染染。反反转转录录 检检测测 干干扰扰效效率率
3、，法法检检测测细细胞胞增增殖殖倍倍数数，流流式式细细胞胞术术检检测测细细胞胞凋凋亡亡率率和和线线粒粒体体膜膜电电位位变变化化，试试剂剂盒盒检检测测超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶（）、丙丙二二醛醛（）和和乳乳酸酸脱脱氢氢酶酶（）含含量量，法法检检测测 相相关关 蛋蛋白白（）、拮拮抗抗剂剂 杀杀伤伤因因子子（）、胱胱天天蛋蛋白白酶酶 （）、线线粒粒体体分分裂裂蛋蛋白白 （）、线线粒粒体体融融合合蛋蛋白白（）、线线粒粒体体融融合合蛋蛋白白（）、视视神神经经萎萎缩缩蛋蛋白白（）、磷磷酸酸化化的的胞胞外外信信号号调调节节激激酶酶（）和和磷磷酸酸化化的的线线粒粒体体动动力力蛋蛋白白相相关关蛋蛋白白（）水水平
4、平。结结果果 与与 组组比比较较，处处理理的的 组组 细细胞胞 表表达达水水平平显显著著降降低低，细细胞胞增增殖殖倍倍数数显显著著增增高高，细细胞胞凋凋亡亡率率显显著著降降低低，含含量量增增高高，和和 含含量量降降低低，线线粒粒体体膜膜电电位位显显著著增增高高，、和和 蛋蛋白白水水平平均均显显著著降降低低。结结论论 干干扰扰 表表达达可可促促进进 诱诱导导的的 细细胞胞增增殖殖，抑抑制制细细胞胞凋凋亡亡，降降低低线线粒粒体体氧氧化化应应激激水水平平及及增增强强线线粒粒体体膜膜电电位位，抑抑制制心心肌肌细细胞胞线线粒粒体体过过度度融融合合与与分分裂裂。关关键键词词 ；心心肌肌细细胞胞；线线粒粒体
5、体融融合合；线线粒粒体体分分裂裂 中中图图分分类类号号 ，文文献献标标志志码码 ，；，；，；，：（），（），（），（），（）（），（），（），（），（），（）（），细胞与分子免疫学杂志（），（）DOI:10.13423/ki.cjcmi.009478 ，；心心肌肌细细胞胞能能量量代代谢谢障障碍碍是是由由线线粒粒体体融融合合、分分裂裂异异常常所所引引起起的的，线线粒粒体体是是细细胞胞能能量量代代谢谢及及能能量量供供应应的的主主要要细细胞胞器器，同同时时，线线粒粒体体还还参参与与细细胞胞凋凋亡亡、氧氧化化应应激激及及细细胞胞信信号号转转导导等等过过程程 。研研究究发发现现，微微小小 （）在在多多种
6、种肿肿瘤瘤细细胞胞发发生生发发展展和和心心肌肌细细胞胞损损伤伤中中发发挥挥调调控控作作用用 。但但 在在心心肌肌细细胞胞线线粒粒体体融融合合与与分分裂裂中中的的作作用用尚尚未未见见报报道道，且且 过过表表达达对对氧氧糖糖剥剥夺夺 复复氧氧（，）诱诱导导的的心心肌肌细细胞胞线线粒粒体体损损伤伤作作用用机机制制也也并并未未明明确确，本本研研究究通通过过干干扰扰 心心肌肌细细胞胞 表表达达，观观察察干干扰扰 表表达达对对 诱诱导导的的心心肌肌细细胞胞增增殖殖、凋凋亡亡及及线线粒粒体体融融合合与与分分裂裂的的影影响响，从从细细胞胞水水平平上上初初步步研研究究过过表表达达 在在心心肌肌损损伤伤中中对对线
7、线粒粒体体的的作作用用。材材料料和和方方法法 材材料料 细细胞胞由由中中国国科科学学院院上上海海细细胞胞研研究究所所提提供供。抑抑制制物物阴阴性性对对照照（，）和和 抑抑制制物物（，）由由上上海海吉吉玛玛制制药药技技术术有有限限公公司司合合成成；培培养养基基、胎胎牛牛血血清清（，）、胰胰蛋蛋白白酶酶和和 购购自自 公公司司；二二辛辛可可宁宁酸酸（，）蛋蛋白白质质定定量量试试剂剂盒盒、裂裂解解液液、法法试试剂剂盒盒、异异硫硫氰氰酸酸荧荧光光素素标标记记的的膜膜联联素素 碘碘化化丙丙啶啶（，）细细胞胞凋凋亡亡检检测测试试剂剂盒盒和和，四四氯氯 ，四四乙乙基基苯苯并并咪咪唑唑碘碘化化羰羰花花青青（，
8、）染染色色液液购购自自上上海海碧碧云云天天生生物物技技 术术 有有 限限 公公 司司；超超 氧氧 化化 物物 歧歧 化化 酶酶（，）、丙丙二二醛醛（，）和和乳乳酸酸脱脱氢氢酶酶（，）试试剂剂盒盒均均购购自自北北京京索索莱莱宝宝科科技技有有限限公公司司；兔兔抗抗 淋淋巴巴细细胞胞瘤瘤因因子子 （，）相相 关关 蛋蛋 白白（，）多多克克隆隆抗抗体体、小小鼠鼠抗抗 拮拮 抗抗 剂剂 杀杀 伤伤 因因 子子（，）单单克克隆隆抗抗体体、兔兔抗抗胱胱天天蛋蛋白白酶酶 （）多多克克隆隆抗抗体体、兔兔抗抗裂裂解解型型胱胱天天蛋蛋白白酶酶（，）多多克克隆隆抗抗体体、兔兔抗抗线线粒粒体体分分裂裂蛋蛋白白 （，）多
9、多克克隆隆抗抗体体、兔兔抗抗线线粒粒体体融融合合蛋蛋白白 （，）多多克克隆隆抗抗体体、小小鼠鼠抗抗 单单克克隆隆抗抗体体、兔兔抗抗视视神神经经萎萎缩缩蛋蛋白白 （，）多多克克隆隆抗抗体体、兔兔抗抗胞胞外外信信号号调调节节激激酶酶（，）多多克克隆隆抗抗体体、兔兔抗抗磷磷酸酸化化的的 （，）多多克克隆隆抗抗体体、兔兔 抗抗 动动 力力 蛋蛋 白白 相相 关关 蛋蛋 白白 （，）多多克克隆隆抗抗体体、兔兔抗抗磷磷酸酸化化动动力力蛋蛋白白相相关关蛋蛋白白 （，）多多克克隆隆抗抗体体、辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶（，）标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 、标标记记的的山山羊羊抗抗小小鼠鼠 及及兔兔抗抗 肌肌动
10、动蛋蛋白白（）抗抗体体购购自自 公公司司。方方法法 细细胞胞培培养养及及建建模模 心心肌肌细细胞胞用用含含 和和 培培养养基基，于于 、细细胞胞培培养养箱箱中中培培养养。将将细细胞胞分分为为正正常常对对照照组组、模模型型组组、阴阴性性对对照照组组（处处理理的的 组组）、干干扰扰组组（处处理理的的 组组）。待待细细胞胞生生长长汇汇合合度度达达 且且生生长长状状态态良良好好时时进进行行 处处理理，诱诱导导：丢丢弃弃原原有有的的培培养养基基，用用 清清洗洗 次次，加加入入不不含含 的的无无糖糖 培培养养基基，置置于于细细胞胞培培养养箱箱中中孵孵育育 ；然然后后，转转移移至至缺缺氧氧细细胞胞培培养养箱
11、箱中中（，），孵孵育育 。取取出出细细胞胞，将将培培养养基基换换成成含含 的的 培培养养基基，、培培养养箱箱中中培培养养。处处理理的的 组组细细胞胞转转染染 ，干干扰扰组组细细胞胞转转染染 ，后后收收集集细细胞胞进进行行后后续续实实验验。反反转转录录 检检测测 干干扰扰效效率率 收收集集对对数数生生长长期期的的 细细胞胞，用用 试试剂剂盒盒提提取取细细胞胞总总 ，采采用用紫紫外外分分光光光光度度仪仪测测量量 浓浓度度和和纯纯度度。按按逆逆转转录录试试剂剂盒盒说说明明书书合合成成 ，按按反反转转录录 试试剂剂盒盒说说明明书书配配制制反反应应体体系系。待待反反应应完完成成后后，放放入入 仪仪中中进
12、进行行反反转转录录 反反应应。反反应应体体系系为为 ，其其中中 ，上上 游游 引引 物物 和和 下下 游游 引引 物物 各各 ，模模板板 ，。反反应应条条件件为为：预预变变性性 ，（变变性性 ，退退火火 ，延延伸伸 ）个个循循环环；以以目目的的基基因因和和内内参参比比值值表表示示 相相对对表表达达水水平平，采采用用 法法分分析析结结果果。引引 期 熊霞霞，等 干扰 抑制氧糖剥夺 复氧诱导的大鼠 心肌细胞线粒体融合与分裂物物由由上上海海生生工工生生物物工工程程有有限限公公司司合合成成：上上游游引引物物为为 ，下下游游引引物物为为 ；上上游游引引物物为为 ，下下游游引引物物为为 。法法检检测测 细
13、细胞胞增增殖殖倍倍数数 收收集集 生生长长汇汇合合度度且且状状态态良良好好的的对对数数生生长长期期的的 细细胞胞，按按 个个 孔孔铺铺入入 孔孔板板中中，按按 试试剂剂盒盒操操作作说说明明书书进进行行检检测测。每每孔孔设设置置 个个复复孔孔，、条条 件件 下下 继继 续续 培培 养养 。离离心心 ，弃弃上上清清；加加入入含含 试试剂剂的的 培培养养基基避避光光孵孵育育 ，于于酶酶标标仪仪下下检检测测 处处吸吸光光度度（）值值。流流式式细细胞胞术术检检测测细细胞胞凋凋亡亡率率和和线线粒粒体体膜膜电电位位变变化化 收收集集对对数数生生长长期期的的各各组组 心心肌肌细细胞胞，加加入入胰胰蛋蛋白白酶酶
14、消消化化贴贴壁壁的的细细胞胞，收收集集细细胞胞并并置置于于 离离心心管管中中，避避光光先先后后加加入入 、溶溶液液各各 ，待待混混合合均均匀匀后后，室室温温下下避避光光孵孵育育 ，流流式式细细胞胞术术检检测测并并分分选选细细胞胞。为为横横坐坐标标，为为纵纵坐坐标标，象象限限为为晚晚期期凋凋亡亡细细胞胞，象象限限为为正正常常细细胞胞，象象限限为为早早期期凋凋亡亡细细胞胞。取取各各组组对对数数生生长长期期的的 细细胞胞并并制制成成细细胞胞悬悬液液，用用 重重悬悬 次次，加加 染染色色液液于于 条条件件下下避避光光孵孵育育 ，用用提提前前预预冷冷的的 染染色色缓缓冲冲液液洗洗涤涤 次次，加加入入 的
15、的 培培养养基基，于于流流式式细细胞胞仪仪上上进进行行检检测测。正正常常细细胞胞中中 聚聚集集在在线线粒粒体体中中发发现现红红色色荧荧光光，凋凋亡亡细细胞胞因因 以以单单体体形形式式存存在在胞胞质质中中发发出出绿绿色色荧荧光光，计计算算红红 绿绿荧荧光光比比值值作作为为线线粒粒体体膜膜电电位位水水平平。试试剂剂盒盒检检测测 细细胞胞 、和和 含含量量 收收集集对对数数生生长长期期且且生生长长状状态态良良好好的的 细细胞胞，按按前前述述方方法法分分组组处处理理细细胞胞，严严格格按按照照 、和和 试试剂剂盒盒说说明明书书进进行行操操作作。法法检检测测 细细胞胞 、和和 蛋蛋白白水水平平 收收集集对
16、对数数生生长长期期且且生生长长状状态态良良好好的的 细细胞胞，胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化细细胞胞后后制制成成细细胞胞悬悬液液；、条条件件下下离离心心 ，取取上上清清。用用 蛋蛋白白裂裂解解液液于于冰冰上上提提取取细细胞胞总总蛋蛋白白，蛋蛋白白定定量量试试剂剂盒盒测测定定蛋蛋白白浓浓 度度。经经 分分 离离、转转 模模、脱脱脂脂奶奶粉粉封封闭闭后后，加加入入兔兔抗抗 多多克克隆隆抗抗体体（）、小小鼠鼠抗抗 单单克克隆隆抗抗体体（）、兔兔抗抗 多多克克隆隆抗抗体体（）、兔兔抗抗 多多克克隆隆抗抗体体（）、兔兔抗抗 多多克克隆隆抗抗体体（）、兔兔抗抗 多多克克隆隆抗抗体体（）、小小鼠鼠抗抗 单单克克隆隆抗抗体体（）、兔兔抗抗 多多克克隆隆抗抗体体（）、兔兔抗抗 多多克克隆隆抗抗体体（）、兔兔抗抗 多多克克隆隆抗抗体体（）、兔兔抗抗 多多克克隆隆抗抗体体（）、兔兔抗抗 多多克克隆隆抗抗体体（）、兔兔抗抗 抗抗体体（），摇摇床床孵孵育育过过夜夜；洗洗涤涤后后，加加入入 标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 或或 标标记记的的山山羊羊抗抗小小鼠鼠 （），室室温温避避光光孵孵育育 ；采采用用 进进行行化化学学