1、第 卷第期 草地学报 年 月 ：甘肃陇西黄芩灰霉病病原菌分离鉴定及田间药剂防治孙雪艳，蒋晶晶，杜蕙，陈爱昌，张敏敏，漆永红（临洮县农业技术推广中心，甘肃 定西 ；甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃 兰州 ；定西市植保植检站，甘肃 定西 ；甘肃省农业科学院生物技术研究所，甘肃 兰州 ）收稿日期：；修回日期：基金项目：甘肃省农业科学院创新专项（，）；兰州市科技计划项目（）；国家重点研发计划（）资助作者简介：孙雪艳（），女，甘肃临洮人，学士，高级农艺师，主要从事中药材等经济作物栽培及试验示范推广，：；蒋晶晶（），女，甘肃榆中人，硕士，助理研究员，主要从事经济作物病害综合防控，：；通信作者 ，：；摘
2、要：为探明黄芩（）茎基部和根部灰霉病的病原菌，本文于 年春季对甘肃陇西县采集的黄芩病样进行病原菌的分离培养，运用形态学和内转录间隔区（，）、甘油醛磷酸脱氢酶（，）、热激蛋白（，）和 聚合酶亚基（，）多基因方法鉴定，采用菌丝生长抑制法进行药剂室内毒力测定和田间药剂防治试验。结果表明：引起黄芩灰霉病的病原菌为灰葡萄孢（），春季发病时表现为地上部分枯死不发芽，靠近地表的根表面呈暗绿色水渍状，随后地下根木质部变软呈黄褐色腐烂，病健交界明显；室内毒力测定表明，咯菌腈对灰葡萄孢菌的抑菌作用最强，为 ，其次为 啶酰菌胺和 腐霉利，分别为 和 ；田间药剂防治试验表明，咯菌腈 对黄芩灰霉病的防效最高，达 。上述
3、研究为黄芩灰霉病病害诊断和田间药剂防治提供重要理论依据。关键词：黄芩；灰霉病；灰葡萄孢；毒力测定；药剂防治中图分类号：.文献标识码：文章编号：（），（，；，；，；，）：，（），（），（）（），.，.，.草地学报第 卷 ：；黄芩（）为唇形科（）黄芩属（）植物，是多年生草本植物。从药用植物学角度，黄芩分为根、茎叶、种子和种壳四个部位，以根和种子入药，味苦，性寒，有消炎、健胃等功效。黄芩主产于我国北方的甘肃、陕西、山西等省，其中甘肃省定西市作为道地黄芩主产区之一，生产的黄芩具有产量高、品质佳、功效好等优势。近年来，黄芩种植面积逐步扩大，生产上连年种植，导致黄芩上的病害呈加重趋势。目前，国内已报道危害
4、黄芩的主要病害和病原菌为：镰孢属（）引起的根腐病、北方根结线虫（）引起的根结线虫病、齐整小核菌（）引 起 的 叶 枯 病、白 粉 菌 属（）引 起 的 白 粉 病、立 枯 丝 核 菌（）引起的茎基腐病等。灰霉病发生寄主范围广，包括蔬菜、果树、中药材等 多种农作物并遍布全世界，给农业造成了严重的经济损失。中药材灰霉病有很多报道，李美芽等鉴定出白及叶斑灰霉病的病原菌为灰葡萄孢；支叶研究表明，刺五加灰霉病的病原菌为灰葡萄孢；马维思等报道，引起滇重楼花器腐烂的灰霉病病原菌为葡萄孢属个新种；吴大椿和严清平研究发现，引起盾叶薯蓣叶、茎呈暗绿色至黑褐色水渍状软腐灰霉病的病原菌为灰葡萄孢；陈书珍报道，灰葡萄孢
5、是甘肃省党参灰霉病的主要病原菌；王帆帆等发现，湖北和湖南两省华重楼灰霉病的病原为灰葡萄孢；游景茂等研究发现，湖北省铁皮石斛叶部灰霉病的病原菌为灰葡萄孢。国内关于黄芩灰霉病的报道很少，发病部位局限于茎秆和叶部，且仅通过形态学特征进行病原菌鉴定 ，但关于危害黄芩茎基部和根部的灰霉病的病原菌未见报道。本试验对甘肃陇西县危害黄芩茎基部和根部的灰霉病进行调查，采集症状典型的样品进行病原菌分离鉴定，通过柯赫法则进行致病性测定，开展室内和田间药效试验，旨在明确该病害的危害程度、发病症状和病原菌种类并筛选出好的药剂，为该病害的科学诊断及田间防治提供重要参考。材料与方法 试验材料 样品采集 年连续年于每年月 在
6、 黄 芩 主 产 区 甘 肃 省 陇 西 县 福 星 镇（，）、首阳镇（，）、菜子镇（，）和通安驿镇（，），每个地区随机选取块田进行病根调查和采集，共获得 份样品，观察并记录病害相关的症状，调查发病情况，将病样置于自封袋中，保持新鲜状态，及时带回实验室进行病原菌分离。致病性测定供试黄芩种子及一年生黄芩苗，品种为 甘肃 黄芩。培养基马铃薯葡萄糖琼脂（）培养基：参照常规方法制备。水琼脂培养基（）培养基：琼脂、蒸馏水 ，灭菌备用。培养基：，溶于 去 离 子 水 中，将 两者混合后 用 （）溶解沉淀，天冬酰胺，葡萄糖，琼脂，加去离子水至 ，灭菌备用。药剂室内毒力测定药剂：腐霉利原药，江西禾益化工有限公
7、司；异菌脲原药，新兴农化工（南通）有限公司；咯菌腈原药，河北冠龙农化有限公司；嘧霉胺原药，江苏丰登作物保护股份有限公司；啶酰菌胺原药，江苏省南通嘉禾化工有限公司。田间防治试验药剂：腐霉利可湿性粉剂（），浙江威尔达化工有限公司；啶酰菌胺水分散粒剂（），山东兆丰年生物科技有限公司；异菌脲悬浮剂（），江苏省苏州富美实植物保护剂有限公司；咯菌腈悬浮剂（），山东省青岛凯源祥化工有限公司。试验方法 病原菌分离纯化采用组织分离法，将春季不发芽的病株整体挖出，经清水冲洗后，选择具有典型暗绿色软腐状的病根，在病根表皮病健交界处及撕开的木质部病健交界处刮或剪取 的病组织，用次氯酸钠溶液消毒，酒精消毒，灭菌水冲洗次
8、后置于灭菌滤纸上晾干。将病组织移至 平板上，每皿 块，置 恒温培养箱黑暗培养，挑取菌落边缘菌丝进行纯化后转接 斜面，保存备用。病原菌形态观察用灭菌打孔器在菌落边第期孙雪艳等：甘肃陇西黄芩灰霉病病原菌分离鉴定及田间药剂防治缘打出直径 的菌饼分别接种在 培养基平板中央，设个重复，置 黑暗恒温条件下培养 后观察菌落、菌核的颜色和形态并在光学显微镜（）下观察形态特征及测量大小。致病性测定改良烧杯水琼脂法：菌株活化后，在菌落边缘打取菌饼，置于已灭菌 培养基（）的一次性小纸杯中央，每杯放入个菌饼，盖上灭菌锡箔纸；在、相对湿度 的人工气候箱中黑暗培养。黄芩种子先用 酒精消毒 ，再用 溶液消毒 ，灭菌水冲洗次
9、后，置于垫有保湿滤纸的已灭菌玻璃培养皿中，在 培养箱中黑暗保湿催芽。挑取发芽一致的种子均匀摆放在带菌 培养基上，以不接菌的 培养基为对照，每杯放入粒，每个菌株次重复，用灭菌锡纸封口后放入，光照，黑暗、相对湿度 的人工气候箱中，待黄芩苗长至纸杯口时揭去锡纸。后观察发病情况，统计发病幼苗数，计算发病率，发病率（）发病幼苗数幼苗总数 。离体根部接种法：将纯化的菌株接种于 平板上，黑暗恒温培养，用直径灭菌打孔器打取菌块备用。将一年生健康黄芩幼根消毒后置于铺有灭菌浸湿纱布的铁盘中，用无菌接种针在黄芩根部表面刺伤四个定点，接种菌株于定点上，以刺伤接种空白 培养基为对照，每个根上接个菌饼，每处理重复次。接菌
10、后用保鲜膜包裹铁盘，培养箱中黑暗培养、观察并记录发病清况。后观察记录离体根感病形态并对病变部位进行组织分离，鉴定分离到的病菌是否与原始病菌相同。病原菌分子生物学鉴定将菌株分别接种于表面平铺灭菌玻璃纸的 平板中央，黑暗培养，收集菌丝于陶瓷研钵中，加入适量液氮研磨成细粉，刮取 粉末于 离心管，用试剂盒（）提取基因组。从 年及 年分离的菌株中各随机选取株，利用 ，基因 ，进行 扩增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公 司 合 成，扩 增 条 件 见 表。反 应 体 系：，引物各，。制备 琼脂糖凝胶，电泳 ，溶液中染色 ，置于 凝 胶成像仪 进 行 拍 照 保 存。将具特异性条带 产物送上海生工生物
11、工程（上海）股份 有 限公 司测序，所测序列与 的 数据库中已知核酸序列进行相似性比较，多基因测序结果采用 将所有基因比对并将比对结果首尾相连，利用 软件进 行 校 正；通 过 软 件 以 邻 接 法（）重复 次进行聚类分析，构建系统发育树。表引物序列 基因 引物 引物序列（）（）扩增程序 预变性 ；变性，复性，延伸，共 个循环；最后 延伸 预变性 ；变性，复性，延伸，共 个循环；最后 延伸 预变性 ；变性，复性，延伸，共 个循环；最后 延伸 预变性 ；变性，复性，延伸，共 个循环；最后 延伸 病原菌中.的检测利用灰葡萄孢特异性检测引物 对分离获得的所有菌株的 进行 扩增，检测所有菌株中的.。
12、引 物 （）和 （）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应体系：，引物各，。反应程序：预变性 ，变性，复性，延伸，共 个循环，延伸 ，保温 。制备含核酸染料的 琼脂糖凝胶，电泳 ，置于凝胶成像仪进行拍照保存。杀菌剂对灰葡萄孢（.）菌丝生长的影响采用菌丝生长抑制率法。用丙酮将原药配成有效成分浓度为（）的母液用于后续稀释，每种杀菌剂设个不同的浓度梯度（表）。将供试菌株活化培养后，在菌落边缘打草地学报第 卷取直径为 的菌饼，分别接入不同浓度杀菌剂的培养基平板中央，其中腐霉利、啶酰菌胺、异菌脲、咯菌腈使用 培养基，嘧霉胺使用 培养基。以不含药 和 培养基为空白对照，每处理次重复，置于 恒温黑暗
13、培养箱培养观察，第采用十字交叉法量取菌落直径，计算菌丝生长抑制率，以杀菌剂浓度的对数值作为自变量（）和菌丝生长抑制率的几率值作为因变量（），利用最小二乘法建立“浓度对数几率值”，建立回归方程 ，采用 、数据处理软件计算得到相关系数（）和致死中浓度（），根据 分析比较不同杀菌剂对供试病原菌的毒力效果。表供试药剂及其浓度 药剂 浓度 腐霉利原药 啶酰菌胺原药 异菌脲原药 咯菌腈原药 嘧霉胺原药 田间防治试验试验地位于甘肃陇西福星镇黄芩结籽田，于 年 月 日黄芩割茎后进行喷药。选择室内药效较好的药剂，每种药剂按照推荐浓度喷施，每个小区面积，每处理次重复，以喷施清水为空白对照。年月 日调查各处理小区黄
14、芩苗发芽情况，每小区连续调查 株，共 株进行各处理防效调查。记录调查总株数及病株数，计算病株率和防治效果。病株率（）病株数 总调查株数 ；防治效果（）（对照病株率处理病株率）对照区病株率 。结果与分析 黄芩灰霉病田间发病症状该病在 年生地块发生严重，病田率 以上，病株率 ，田块形成斑秃（图）。茎秆自下而上变为黄褐色，后病斑扩展为中央灰褐色，边缘黑褐色绕茎一周，湿度大时产生灰色霉层，后期全株失绿枯死（图）；地下根部表面呈暗绿色至黑褐色水渍软腐状，发病根部由上而下逐渐软腐，病斑扩大后绕茎一周（图），撕开表皮，木质部变软呈黄褐色，发病严重时整个根内部变褐色腐烂（图，）。形态学鉴定特征 年每年春季分别
15、从甘肃省陇西县福星镇、首阳镇、菜子镇和通安驿镇等黄芩主产区采集典型不发芽的病根共计 份，分离纯化得到 株菌株（表）。培养基 恒温、黑暗培养 后，株菌株的菌落特征表现出明显差异，其中株为菌丝型，株为菌核型，未发现孢子型。初期菌丝稀疏，大多数为白色放射状，后期菌丝体颜色逐渐加深，形成球状或不规则的黑色菌核（图 ）。分生孢子梗细长，淡褐色，直立或稍弯曲，丛生、单支或树状分枝；分生孢子梗顶端膨大成球型，并形成小柄，小柄上着生大量分生孢子，形状似葡萄穗状（图）。分生孢子为单孢，近圆形、无色，大小约为 （图）。根据形态学特征，将分离获得的 株菌株初步鉴定为灰葡萄孢菌（.）。图黄芩灰霉病发病症状 注：，春季
16、田间发病症状；，茎基部发病；，根部发病 ：，；，；，第期孙雪艳等：甘肃陇西黄芩灰霉病病原菌分离鉴定及田间药剂防治表陇西县不同地区菌株的分离信息 采样年份 菌株编号 采样地点 ，通安驿镇高阳村 ，通安驿镇牛站村 ，首阳镇李家营村 ，福星镇高台山村 ，福星镇裴家湾村 ，福星镇庞家岔村 ，菜子镇二十铺村 ，菜子镇中川村 ，福星镇李家营村 ，图黄芩灰霉病菌的形态特征 注：，菌落形态（，）；，分生孢子梗和分生孢子；，分生孢子和菌丝；标尺 ：，（，）；，；，；致病性测定改良烧杯水琼脂法致病性测定结果表明，株菌株均经过柯赫法则验证，对催芽的黄芩根部和茎全都有极强的致病性，发病率达 （图），而对照草地学报第 卷接种没有发病，黄芩幼苗长势良好（图）。随机选取一部分菌株利用离体根部接种法测定菌株致病性，结果表明，接种后，在接种部位产生明显的暗绿色软腐病斑（图）；随着病斑逐渐扩展，第整个接种根部呈暗绿色软腐状，并有少量的菌丝缠绕或菌核产生，而对照接种根没有发病（图）。将上述发病根重新分离，分离率为 ，且与原接种菌一致，表明该病原菌是引起黄芩灰霉病的致病菌。图致病性测定 注：，黄芩幼苗接种 后；，；，离体根接