1、Chinese Journal of Practical Stomatology Jan.2023 Vol.16 No.1论著DOI：10.19538/j.kq.2023.01.010种植修复患者唾液与龈下菌斑微生物群落结构关联及其影响因素研究黄瑾1，赵芮1，马青1，方明1，董岩1，张凌1，吉兆华2，田敏1，陈吉华1摘要：目的利用高通量测序技术研究种植修复患者唾液与龈下菌斑微生物群落结构的关联及其影响因素，为种植体周微生物研究的样本选择提供参考。方法选取于2014年6月至2015年9月在第四军医大学口腔医院口腔修复科完成种植修复的10例患者（12颗种植体），于2021年11月至2022年1月随
2、访复诊时采集其唾液和种植体周龈下菌斑样本，行16S rRNA V3 V4区双端测序，通过Alpha多样性分析和LEfSe多级物种差异判别分析其微生物群落丰富度、多样性及物种丰度的差异性。结果在Alpha多样性分析中，Sobs指数和Chao指数显示，唾液中微生物群落丰富度大于龈下菌斑，差异均有统计学意义（均P 0.05）。进一步分析发现，种植体周围黏膜炎患者和吸烟患者的唾液与龈下菌斑微生物群落丰富度差异无统计学意义（均P 0.05）；男性、不饮酒、种植体周最大探诊深度 5 mm的患者唾液与龈下菌斑微生物群落多样性差异有统计学意义（均P 0.05）；其他因素如不同年龄、软垢指数、牙石指数、角化黏膜
3、宽度、固位方式、改良龈沟出血指数、边缘骨吸收量、牙周炎患病状况的患者唾液与龈下菌斑微生物群落丰富度差异有统计学意义（均P 0.05）。LEfSe分析显示，唾液与龈下菌斑微生物组成相似，在属水平、种水平分别仅有7种和12种微生物具有差异（均P 0.05）。结论种植修复患者唾液与龈下菌斑微生物群落结构关联密切，男性、不饮酒、种植体周最大探诊深度 5 mm对种植修复患者唾液及龈下菌斑微生物群落关联有影响，若无此类影响因素可考虑用唾液替代种植体周围龈下菌斑进行种植体周微生物群落多样性的研究。关键词：种植体；龈下菌斑；唾液；16S rRNA测序中图分类号：R78文献标志码：ACorrelation be
4、tween saliva and subgingival plaque microbial community structure and its influencing factors inpatients with implant restorationHUANG Jin*，ZHAO Rui，MA Qing，FANG Ming，DONG Yan，ZHANG Ling，JIZhao-hua，TIAN Min，CHEN Ji-hua.*Department of Prosthodontics，Hospital of Stomatology，the Fourth Military Medical
5、 University&State Key Laboratory of Military Stomatology&National Clinical Research Center for Oral Diseases&Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xian 710032，ChinaCorresponding author：TIAN Min，E-mail：；CHEN Ji-hua，E-mail：Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship between saliva and the subgin
6、gival plaque microbial communitystructure of patients with implant restorations and its influencing factors using high-throughput sequencing technology，and to serve as a guide for the sample selection of peri-implant microbiological research.MethodsSaliva andperi-implant subgingival plaque samples w
7、ere collectedfrom 10 patients（12 implants）at their follow-up visit between November 2021 and September 2022，who completed implant restorations in the Department of Prosthodontics，Stomatological Hospital of the Fourth Military Medical University from June 2014 to September 2015.Thedouble-ended 16S rR
8、NA V3-V4 sequencing was per基金项目：国家自然科学基金国际（地区）合作与交流项目（81720108011）；陕西省重点科技创新团队（2020TD-033）作者单位：1.第四军医大学口腔医院口腔修复科，军事口腔医学国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，陕西省口腔医学重点实验室，陕西 西安 710032；2.空军军医大学军事预防医学系军队防疫与流行病学教研室，特殊作业环境危害评估与防治教育部重点实验室，陕西 西安 710032通信作者：田敏，电子信箱：；陈吉华，电子信箱：54中国实用口腔科杂志 2023年 1月 第 16卷 第 1期种植修复具有较多的生物学并发症，
9、第六届欧洲牙周病学研讨会共识报告指出，菌斑生物膜是种植体周围病的始动因素，致病菌的定植可引发宿主一系列的免疫炎症反应，最终导致种植体周围牙槽骨吸收，对种植体稳定性和成功率造成不良影响1。目前对于种植修复患者口腔微生物的研究越来越多，大多研究采集龈下菌斑或龈沟液样本，而这两种样本采集位点有限，技术敏感性高，还易受修复体和龈上菌斑的影响。有研究显示种植体在植入几分钟到几小时后，细菌通过由唾液来源的蛋白和多糖形成的获得性膜在种植体表面黏附，2周内形成复杂的黏膜下微生物区系，而龈下菌斑与唾液同处于口腔环境中，两者微生物群落结构可能存在相关性2。唾液作为口腔微生物组的采集样本之一，具有易于收集、量多和无
10、创的特征，且采集者不需要特殊的训练。然而唾液和龈下菌斑的微生物相似性及相关性研究较少。本研究拟通过16S rRNA基因测序技术对种植修复患者唾液及龈下菌斑微生物群落结构相似性和差异性及影响因素进行研究，为种植体周微生物研究的样本选择提供参考。1材料与方法1.1研究对象选取于2014年6月至2015年9月在第四军医大学口腔医院口腔修复科完成种植修复的10例患者，共12颗种植体。于2021年11月至2022年1月随访复诊时，采集这些患者的唾液和种植体周龈下菌斑样本。纳入标准：牙列缺损行种植体支持的冠或桥修复者；颌位关系基本正常；同意并配合完成样本采集。排除标准：患有口腔黏膜病；妊娠或哺乳期患者；近
11、3个月服用过抗生素；患有精神及心理疾病；龈下菌斑可采集量不足。本研究经第四军医大学口腔医院伦理委员会审查批准（批准号：IRB-REV-2021079），所有患者均知情同意并签署知情同意书。1.2样本采集、DNA提取及测序唾液样本采集：请患者前倾至置于冰上的无菌杯上方，收集自然流下的唾液约2 mL，用移液器将唾液转移至2 mL无菌冻存管中并放置在-80保存。龈下菌斑样本采集：使用龈上刮治器去除龈上菌斑及软垢，棉球干燥隔湿，用Gracy刮治器沿种植体周围formed.Alpha diversity analysis and LEfSe analysis were used to study the
12、 differences in microbial community richness，diversity，and species abundance.ResultsIn the Alpha diversity analysis，Sobs and Chao index showed that the microbial community richness in saliva was greater than that in subgingival plaque，and the differences were statistically significant（P 0.05）.Furthe
13、r analysis showedthat there were no significant differences in the richness of microbial communities in saliva and subgingival plaque between patients with peri-implant mucositis and those who smoked（P 0.05），while the differences in saliva and subgingival plaque community diversity were statisticall
14、y significant in male，non-alcoholic patients and patients with implantmaximum probing depth 5 mm（P 0.05）.LEfSe analysis showed thatthe microbial compositions of saliva and sub-gingival plaque were similar，and only 7 and 12 microbial species were different at the genus and species levels，respectively
15、（P 0.05）.ConclusionSaliva is closely correlated with the microbial community structure of the subgingival plaque in patients with implant restoration.The link between saliva and thesubgingival plaque microbial community in patients with implant restoration is influenced by male，no alcohol consumptio
16、n，and peri-implant maximum probing depth 5 mm.For the study of peri-implant microbial community diversity，saliva can be used to replace peri-implant subgingival plaque in the absence of these elements.Keywords：dental implant；subgingival plaque；saliva；16S rRNA sequencing55Chinese Journal of Practical Stomatology Jan.2023 Vol.16 No.1轻轻刮取龈下菌斑，置于1.5 mL微管中；当龈下菌斑量较少时用PBS将取样器上的菌斑冲下，一并放入微管中，于4 h内送至实验室-80保存并提取DNA，合成引物（V3 V4区引物序列如下，F：5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3；R：5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3），并进行 16SrRNA V3 V4区测