1、论著与临床研究高龄与非高龄复发性流产患者行胚胎植入前非整倍体检测的可行性分析蒲艳，郑爱燕，廖桂芝，偶建，王馥新，王玮，丁洁作者单位：江苏 苏州，南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院生殖与遗传中心作者简介：蒲艳，毕业于重庆医科大学，硕士研究生，实验师，主要研究方向为人体解剖与组织胚胎学通信作者，：【摘要】目的 分析高龄及非高龄复发性流产（，）患者行胚胎植入前非整倍体检测（，）后胚胎染色体整倍性以及患者的临床结局，探讨 在两组患者中的临床应用价值。方法 纳入 年 月至 年 月在苏州市立医院生殖与遗传中心行 的高龄组患者（岁，个活检周期，枚囊胚）及非高龄 组患者（岁，个活检周期，枚囊胚），所有囊胚
2、均行滋养外胚层活检，采用二代测序技术（）检测，根据不同囊胚发育天数和胚胎质量分析两组患者胚胎染色体的整倍性，比较同时期胚胎冻融移植周期（，）中行 与未行 的高龄患者、非高龄 患者行 和未行 的临床结局。结果 高龄患者和非高龄 患者 囊胚的非整倍体率均低于 囊胚，其中 非优质囊胚组的非整倍体率最高。周期 高龄组临床妊娠率、种植率和活产率均显著高于未行 高龄组的患者（.），而非高龄 患者中行 组与未行 组临床结局差异无统计学意义（.）。结论 技术有助于改善高龄患者的临床结局，对于非高龄 患者，应谨慎考虑应用 技术。【关键词】；高龄；复发性流产；临床结局【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】（）：
3、.，：【】（）（），（，）（，），（），（），（.），（.），【】（）；年欧洲生殖年会将胚胎植入前遗传学检测（，）的概念引入国际不孕不育与生育保健术语汇编，取代了以往的胚胎移植前基因诊断（，）、胚胎植入前遗传学筛查（，）。包括 个方面：胚胎植入前非整倍体检测（，）、单基因遗传病的检测（，）、染色体结构重排的检测（，）。在国内 目前主要应用于高龄（岁）、不 明 原 因 的 复 发 性 流 产（，），即反复自然流产两次及以上、不明原因反复种植失败（，），即移植 次或移植高评分卵裂期胚胎数 个或高评分囊胚数 个均失败；严重畸精症。这部分患者通过常规的助孕方法很难得到满意的结果，而 技术应用至今仍存在
4、争议。本中心 周期中大多数为高龄及非高龄 患者，本研究拟对这两组患者进行分析，探讨高龄和非高龄 患者胚胎染色体的整倍体性以及 在这两组患者中的临床应用价值，以为不同适应证患者应用 技术提供参考。资料与方法 研研究究对对象象纳入 年 月至 年 月苏州市立医院生殖与遗传中心共 个 周期，考虑到年龄对胚胎染色体的影响，分为两组。纳入标准：高龄组（排除子宫畸形及夫妇双方染色体异常因素），年龄 岁，有或无 病史（个活检周期，枚囊胚）；非高龄 组，患者反复自然流产两次及以上（排除子宫畸形、免疫因素、内分泌因素及夫妇双方染色体异常因素），年龄 岁（个活检周期，枚囊胚）。分别分析两组患者胚胎染色体的整倍性。将
5、胚胎冻融移植周期（，）中行 的高龄 患者与同期未行 的高龄 患者进行比较，分析 在两组患者中的临床应用价值；将 中行 的非高龄 患者与同期未行 的非高龄 患者进行比较，分析 在两组患者中的临床应用价值。研研究究方方法法 取卵及受精根据本中心常规方案行促排卵，患者在扳机后 行阴道 超引导下取卵，后卵丘复合物在透明质酸酶中脱颗粒细胞，成熟卵子采用单精子显微注射方式受精。胚胎培养及活检胚胎在 和（，瑞典）培养液中序贯培养成囊胚，根据囊胚生长情况于第 日或第 日对囊胚滋养外胚层进行活检取样。囊胚评级根据 评分法，内细胞团和滋养外胚层均在 级以上为优质囊胚。二代测序技术（，）对所有活检样本进行全基因组扩
6、增后建库。等温扩增和富集后，使用 测序仪（，美国）进行测序。使用 进行测序结果解读，通过界面分析数据或后台 界面分析数据进行染色体分析，以此判断胚胎的染色体是否正常。囊胚冷冻与复苏囊胚冷冻解冻均采用玻璃化冷冻，所用冷冻解冻液及载杆购自日本 公司。临床结局移植后第 日测血 确认是否妊娠，阳性者于移植后 周 超检查，见孕囊者为临床妊娠，孕 周内自然流产为早期流产。统统计计学学方方法法采用 .软件进行统计学分析，组间均数比较采用方差分析，率的比较采用 检验。.为差异有统计学意义。结果 高高龄龄组组胚胚胎胎 检检测测结结果果高龄组共 个活检周期，活检 枚囊胚，非整倍体率高达.，主要为整条染色体整倍性的
7、异常（.），详见下页表。根据囊胚发育的天数分组，囊胚的非整倍体率高于 囊胚（.），按囊胚的质量分组后显示，非优质囊胚的非整倍体率高于 优质囊胚（.），由于 囊胚数量较少，未纳入分组统计范围，余组间比较差异无统计学意义（.），详见下页表，表。非非高高龄龄 组组胚胚胎胎 检检测测结结果果非高龄 组共 个活检周期，枚囊胚，非整倍体率为.，详见下页表。根据囊胚发育的天数分组（排除 囊胚数），囊胚的非整倍体率显著高于 囊胚（.）；按囊胚的质量分组后显示，非优中国计划生育和妇产科 年 第 卷 第 期质囊胚的非整倍体率显著高于其余 组（.），各组间非整倍体类型差异无统计学意义（.），详见表，表。高高龄龄组组
8、与与未未行行 高高龄龄组组 周周期期临临床床结结局局比比较较比较同期 周期中，高龄组与未行 高龄组（考虑到比较对象的一致性，未行 高龄组均为新鲜周期全冷冻后的囊胚解冻移植周期）临床基本资料比较，差异无统计学意义。高龄组仅移植 枚胚胎，胚胎移植数量显著低于未行 高龄组，高龄组临床妊娠率、种植率及活产率高于未行 高龄组患者（.），早期流产率差异无统计学意义（.），详见下页表。非非高高龄龄 患患者者行行 组组与与未未行行 组组 周周期期临临床床结结局局的的比比较较本研究还比较了同期 周期中非高龄 行 组与非高龄组 未行 组的临床结局。两组患者的临床基本资料中，非高龄 行 组的不孕年限显著增长（.），
9、其余一般资料比较差异无统计学意义（.）。本中心非高龄组 未行 组在新鲜周期均行囊胚培养，故 周期同 周期均移植 枚囊胚。其临床妊娠率、种植率及早期流产率比较，差异均无统计学意义（.），详见下页表。表 高龄组胚胎 检测结果囊胚数非整倍体率单条染色体异常率多条染色体异常率微缺失或微重复率嵌合率（）（）（）（）（）表 高龄组不同发育天数胚胎整倍性比较组别活检胚胎数非整倍体率单条染色体异常率多条染色体异常率微缺失或微重复率嵌合率（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）值 值 表 高龄组不同发育天数及不同质量胚胎整倍性比较组别活检胚胎数非整倍体率单条染色体异常率多条染色体异常率微缺失或微重复率嵌合率 优
10、质囊胚（）（）（）（）（）非优质囊胚（）（）（）（）（）优质囊胚（）（）（）（）（）非优质囊胚（）（）（）（）（）值 值 注：表示 非优质囊胚组与 优质囊胚组比较（.，.）；表示 非优质囊胚与 非优质囊胚组比较，差异无统计学意义（.，.）；表示 非优质囊胚组与 优质囊胚组比较，差异无统计学意义（.，.）表 非高龄 组胚胎 检测结果活检胚胎数非整倍体率单条染色体异常率多条染色体异常率微缺失或微重复率嵌合率（）（）（）（）（）表 非高龄 组不同发育天数胚胎整倍性比较组别活检胚胎数非整倍体率单条染色体异常率多条染色体异常率微缺失或微重复率嵌合率（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）值 值 表 非高
11、龄 组不同发育天数及不同质量胚胎整倍性比较组别活检胚胎数非整倍体率单条染色体异常率多条染色体异常率微缺失或微重复率嵌合率 优质囊胚（）（）（）（）（）非优质囊胚（）（）（）（）（）优质囊胚（）（）（）（）（）非优质囊胚（）（）（）（）（）值 值 注：表示 非优质囊胚胎组与其余 组比较，差异均有统计学意义。表示 优质囊胚组与 非优质囊胚组比较（.，.）；表示 非优质囊胚组与 非优质囊胚组比较（.，.）；表示 优质囊胚组与 非优质囊胚组比较（.，.）。表 高龄组与未行 高龄组 周期临床结局比较周期数平均移植胚胎数年龄（岁）不孕年限（年）（）（）（）（）高龄组 未行 高龄组 值 值激素替代周期率 胚
12、胎移植周期率 胚胎移植周期率优质囊胚移植周期率临床妊娠率种植率早期流产率活产率 高龄组（）（）（）（）（）（）（）（）未行 高龄组（）（）（）（）（）（）（）（）值 值 注：表示两组比较差异有统计学意义（.）。：体质量指数；：抗苗勒管激素；：促卵泡激素；：雌二醇。表 非高龄 患者行 组与未行 组 周期临床结局的比较周期数平均移植胚胎数年龄（岁）不孕年限（年）（）（）（）（）非高龄 行 组 非高龄 未行 组 值 值激素替代周期率 胚胎移植周期率 胚胎移植周期率优质胚胎移植周期率临床妊娠率种植率早期流产率活产率非高龄 行 组（）（）（）（）（）（）（）（）非高龄 未行 组（）（）（）（）（）（）（
13、）（）值 值 注：表示两组差异有统计学意义（.）。讨论 的活检时机经历了从极体活检、卵裂球活检，再到现在普遍采用的囊胚活检 个阶段。囊胚滋养层细胞活检能够得到较多数目的胚胎细胞，最大限度地获得胚胎的遗传信息，且对胚胎的损伤相对较小。而随着 的广泛应用，检测结果的精确性也大大地提高，本研究从囊胚的发育速度和胚胎质量两方面比较不同 适应证患者胚胎的整倍性，并分析了 技术对其妊娠结局的影响。研究表明随着女性年龄的增加，其卵子染色体非整倍体率随之增加，这也是高龄女性妊娠成功率下降的原因之一，本研究对高龄女性患者的 枚囊胚活检后中国计划生育和妇产科 年 第 卷 第 期的 结果进行了分析，发现胚胎染色体非
14、整倍体率高达，进一步验证了高龄女性胚胎染色体的高异常率。高龄组胚胎主要为整条染色体的整倍性异常，其中包括多条染色体和单条染色体的整倍性异常。将所有囊胚根据发育天数分组比较发现，高龄患者 囊胚的非整倍体率显著高于 囊胚。不同发育天数的囊胚根据胚胎质量分组，非优质囊胚组胚胎的非整倍体率高于 优质囊胚组，差异有统计学意义，非优质囊胚组与 优质囊胚组非整倍体率相近，略高于 优质囊胚组，低于 非优质囊胚组，组间比较差异均无统计学意义。由此可见，高龄患者的胚胎非整倍体率较高，特别是生长发育较慢的囊胚，根据胚胎学评分选择胚胎无法达到较高的筛选作用。此外，从本研究对同期 周期中，高龄组与未行 高龄组的临床结局
15、比较发现，两组患者、胚胎移植周期率及优质囊移植周期率差异均无统计学意义，高龄组虽然仅移植 枚胚胎，移植数量显著低于未行 高龄组，但临床妊娠率、种植率及活产率均显著提高，早期流产率差异无统计学意义，进一步说明对于高龄患者，根据胚胎形态学评分选择胚胎移植并无优势，通过 筛选出整倍体胚胎后移植，能显著改善高龄患者的临床结局，减少患者移植的频率。本中心 周期患者主要为高龄患者、患者（排除子宫畸形、免疫因素、内分泌因素及夫妇双方染色体异常因素），余为反复种植失败的患者，后者例数较少，未进行统计分析。研究发现大约 的早期流产是由于染色体异常导致的，在辅助生殖技术中发现，有大部分形态学评分较高的胚胎是非整倍
16、体，不明原因的，也与胚胎染色体整倍性相关。本研究非高龄 组胚胎的非整倍体率为 ，种类型的非整倍体比例相差较小，主要为单条染色体异常和嵌合体。根据囊胚发育天数分组比较，囊胚的非整倍体率低于 囊胚，与高龄患者结果一致。按囊胚的质量分组后显示 非优质囊胚的非整倍体率显著高于其余 组。不同组别间不同类型非整倍体率的比较差异无统计学意义。不同于高龄患者，对比同期 周期中行 的非高龄 组与未行 的非高龄 组，两组的临床妊娠率、种植率、活产率和早期流产率差异均无统计学意义。两组移植的胚胎中、胚胎移植周期率及优质胚胎移植周期率差异均无统计学意义，提示在移植囊胚形态学评分及发育天数无差异的前提下，通过 选择整倍体胚胎移植，并无明显优势。囊胚培养的过程也是胚胎筛选的过程，本研究中高龄组与非高龄 组 囊胚的整倍性都显著高于 囊胚，与多数研究结果一致。线粒体的数量、纺锤体异常都会导致囊胚发育缓慢，从而影响胚胎的整倍体率。但也有部分研究认为囊胚的整倍性与胚胎质量有关，与发育天数无关。本研究的结果还提示，非优质囊胚的非整倍体率最高，但 囊胚组与 优质囊胚组的非整倍体差异不明显。值得注意的是，本研究未行 检测的非高