1、2023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023预防兽医预防兽医竹醋液抑制竹醋液抑制J J亚群禽白血病病毒复制研究亚群禽白血病病毒复制研究张璐1，2，何慧芬1，2，乔丹丹3，许黎明4，许艺威5，秦爱建1，2，钱琨1，2*（1.扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室，江苏扬州225009；2.扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室，江苏扬州225009；3.徐州生物工程职业技术学院，江苏徐州221006；4.四川绿玉君科技股份有限公司，四川宜宾644000；5.广东海鹏竹材研究开发有限公司，广东肇庆526000）摘要：为探讨竹醋液在体外对 J 亚群禽白血病病毒（A
2、vian leukosis virus subgroup J，ALV-J）复制的影响，研究首先通过CCK-8试剂盒测定青皮竹和慈竹两种竹醋液对DF-1细胞毒性，随后将不同浓度竹醋液与ALV-J等体积室温作用不同时间后接种到细胞中，利用qRT-PCR、ELISA和Western blot测定竹醋处理对ALV-J编码基因的转录以及蛋白合成的影响。结果显示：两种竹醋液加入细胞中的最终浓度均2%，对细胞生长没有影响；青皮竹醋和慈竹醋在100%、50%、25%的浓度下与病毒在室温作用10 min、30 min后，细胞中gp37基因表达水平显著下降，细胞与上清中的P27蛋白表达水平也明显下降。研究表明，青
3、皮竹醋和慈竹醋在体外均有明显的抗ALV-J活性。关键词：竹醋液；抗病毒活性；J亚群禽白血病病毒中图分类号：S854.5文献标识码：A文章编号：1004-6364（2023）02-33-06收稿日期：2022-04-20；修回日期：2022-07-27基金项目：国家自然科学基金项目（32072839）；江苏高校“青蓝工程”资助项目（苏教师函 2021 11号）；徐州生物工程职业技术学院自然科学研究项目（XSZR202106）作者简介：张璐（1998-），女，硕士研究生，研究方向为家禽免疫抑制与肿瘤病，E-mail：*通讯作者：钱琨（1979-），男，博士，教授，主要从事家禽免疫抑制与肿瘤病研究，
4、E-mail：doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2023.02.006Antiviral Effects of Bamboo Vinegar on Subgroup J Avian Leukosis VirusZHANG Lu1,2,HE Huifen1,2,QIAO Dandan3,XU Liming4,XU Yiwei5,QIN Aijian1,2,QIAN Kun1,2*（1.Key Laboratory for Avian Preventive Medicine,Ministry of Education,Yangzhou University,Yangzho
5、u,Jiangsu 225009；2.Key Laboratory of Jiangsu Preventive Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu 225009；3.Xuzhou Vocational College of Bioengineering,Xuzhou,Jiangsu 221006；4.Sichuan Lvyujun Technology Co.,Ltd.,Yibin,Sichuan 644000；5.Guangdong Haipeng Bamboo Research and Development C
6、o.,Ltd.,Zhaoqing,Guangdong 526000）Abstract：In order to investigate the effects of bamboo vinegar on replication of avian leukosis virus subgroup J(ALV-J)invitro,the cytotoxicity of Qing and Ci bamboo vinegar to DF-1 cell was detected by CCK-8 kit.Then,different concentrations ofbamboo vinegar and AL
7、V-J were inoculated at room temperature for different time before adding to cells.qRT-PCR,ELISA andWestern blot were used to determine the effect of bamboo vinegar treatment on the encoding genes transcription and protein synthesis of ALV-J.The results showed that the final concentration of the two
8、bamboo vinegar liquids added to the cells was 2%,-332023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023预防兽医预防兽医禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（ALV）引起的一种以鸡群患骨髓细胞性白血病、血管瘤为主要特征的免疫抑制病1。ALV主要存在于病鸡的粪便、血液、胚胎、泄殖腔中，可通过水平传播和垂直传播感染2。根据病毒囊膜蛋白特性不同，目前鸡群中发现的ALV分为7个亚群：A、B、C、D、E、J、K3。与其他亚群相比，J亚群ALV（ALV-J）具有更强的致病性及传播能力，鸡群感染后，
9、会导致疫苗免疫失败4，进而影响鸡生产性能5。目前对于ALV-J还没有针对性的疫苗，也没有有效药物，防控AL的有效方法仍然是阻止病原传播：一方面重点净化核心种鸡群阻断垂直传播，另一方面加强生物安全切断水平传播途径6-7。竹醋液是在竹材热解过程中回收的青黄色或黄棕色的液体，澄清透明，带有其独特的熏香味。竹醋液成分较复杂含有200多种有机成分及数十种矿物质，其主要成分为水、有机酸、酚类、醛类、酮类、醇类、酯类等8。研究显示，竹醋液具有抗菌9、杀虫、除臭、促进植物生长10、保持植物的活性和鲜度、改良土壤等功能，广泛应用于植物生长、环保农业11、病虫害防止、饲料添加剂12、日用化工和环境保护13等领域。
10、目前国内对竹醋液的研究主要集中于农业生产利用方面，对竹醋液抗病毒活性研究鲜有报道。本研究通过测定不同竹醋液对病毒复制水平的影响，探讨竹醋液的体外抗病毒活性，为其在临床中的使用及深度开发提供依据。1材料与方法1.1细胞与病毒鸡胚成纤维细胞系（DF-1）、ALV-J JS09 GY03株（4.22107TCID50/mL）均由本实验室保存。1.2主要试剂与仪器主要试剂：慈竹醋由四川绿玉君竹醋生物科技有限公司提供，青皮竹醋由广东海鹏竹醋生物科技有限公司提供，其主要成分为水约占80%，其次是酚类、有机酸、醛类、酮类、醇类、酯类等；DMEM培养基购自Thermo Fisher公司；胎牛血清购自GIBCO
11、公司；双抗（青霉素/链霉素）购自华北制药股份有限公司；胰蛋白酶购自SIGMA公司；cell counting kit（CCK-8）试剂盒、BCA蛋白质测定试剂盒、反转录试剂盒及荧光染料均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Axyprep Multisource totalRNA Miniprep 试剂盒购自美国 AXYGEN 公司；ECL化学发光显色液购自Bio-Rad公司；ALV-J特异性单克隆抗体5D3、HRP标记酶标二抗4F12均由本实验室制备保存；HRP标记山羊抗鼠IgG、内参-tubulin抗体购自SIGMA公司。主要仪器：4 低温冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；倒置式荧光显微
12、镜购自日本OLYMPUS公司；超灵敏化学发光成像仪购自美国Protein Simple公司；7500型实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；ND-1000型紫外分光光度计购自美国Nano Drop公司；Biotek-800型多功能酶标仪购自Biotek公司。1.3细胞毒性试验将DF-1细胞从液氮中复苏后传代培养，利用0.05%胰酶消化，以3万4万细胞/孔接种至96孔板中，培养长成单层细胞；用DMEM细胞培养液将两种竹醋液倍比稀释为 7 个浓度梯度（25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.5625%、0.78125%），依次接种于96孔板中，100 L/孔，每个竹醋液浓度做4个重复孔
13、，作为试验组，有培养基与细胞的孔作为对照组，仅有培养基不含细胞的孔作为空白组。细胞板放置细胞培养箱培养72 h后，向每孔加入10 L CCK-8 Solution，培养箱中孵育一定时间后，使用酶标仪测定450 nm处的吸光值，将相对细胞存活率确定为每种浓度的百分比=（试验孔-对照孔）/（对照组-空白组）100%。1.4竹醋液体外抗病毒活性测定将两种竹醋液分别用0.85%NaCl溶液稀释成不同浓度梯度（100%、50%、25%），与ALV-J JS09GY03株（最终感染量MOI=1.0）以1 1体积比在体外混合（竹醋液终浓度为50%、25%、12.5%），室温分别作用10 min、30 min
14、。将混合液加入长满单层which had no effect on the cell growth;The expression level of gp37 gene in cells decreased significantly,and the synthesis levelof P27 in cells and supernatant also decreased after 100%,50%and 25%concentration of Qing and Ci bamboo vinegar were reacted with virus at room temperature for
15、10 min and 30 min.The results suggested that both Qing and Ci bamboo vinegar hadstrong anti-ALV-J activity in vitro.Key words：bamboo vinegar;antiviral activity;avian leukosis virus subgroup J-342023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023DF-1细胞的12孔板中，每个浓度做3个重复。不加竹醋液（浓度为0）仅在室温放置10 min、30 min的病毒为阳性对照，正常
16、DF-1细胞为阴性对照。作用3 h后弃掉上清，换细胞维持液继续培养72 h，分别收集培养上清和细胞，上清用于ELISA测定，细胞分别提取RNA和蛋白用于qRT-PCR、Western blot测定。1.4.1ELISA检测细胞上清中ALV-J P27蛋白的表达收集细胞上清，将上清以100 L/孔加入包被有ALV-J P27抗原的酶标板中，同时设置阴阳性对照。37 孵育 1 h，弃去孔内液体，每孔加入 200 LPBST，轻拍洗涤，重复6次。加入HRP标记的酶标二抗4F12，100 L/孔，37 孵育1 h，弃去孔内液体，每孔加入200 L PBST，轻拍洗涤，重复6次。加入显色液，100 L/孔，37 孵育15 min，加终止液，100L/孔，随后利用酶标仪读取650nm处的吸光值。1.4.2qRT-PCR检测细胞中ALV-J gp37基因的表达采用 Axyprep Multisource total RNA Miniprep试剂盒提取细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行反转录，每个体系为16 L，其中4gDNAwiper Mix 4 L，RNA 1 g，添加RNase-free