1、1CS65.020.20B05DB23黑龙江省地方标准DB23/T25252019主要肥效微生物筛选技术规程2019-12-13发布2020-01-12实施黑龙江省市场监督管理局发布DB23/T25252019a)水培法：培养基质为微氮培养液，其配方见附录A6和A7,按照附录B1的步骤完成根瘤菌结瘤能力的验证。b)砂培法：培养基质为加入微氮培养液的石英砂，按照附录B2的步骤完成根瘤菌结瘤能力的验证。c)土培法：培养基质为灭菌土壤，按照附录B3的步骤完成根瘤菌结瘤能力的验证。观察各植株根部结瘤情况，记录植株株高(cm)、主根和侧根的瘤数（个/株）、主根和侧根瘤重(g/株)、地上部鲜重(g/株)。
2、5.2溶磷、解钾菌的筛选5.2.1溶磷、解钾菌的分离称取土样10g,置于装有无菌玻璃珠的三角瓶中，分离溶磷菌应加入90mL无菌水，分离解钾菌应加入0.85%aC1溶液。常温下以160rpm/min的转速振荡20min,制成均匀的土壤悬液。采用10倍稀释法依次配制1010的浓度梯度样液，选取10、105、103个浓度梯度的样液。分离解磷菌时，每次每个浓度样液吸取0.1mL,涂布于PK0无机磷（附录A2)和蒙金娜有机磷（附录A3)固体培养基平板上，每个稀释度设3个重复，30培养箱中倒置培养7d:分离解钾菌时，每次每个浓度样液吸取0.1mL,涂布于解钾菌筛选培养基（附录A4)平板上，每个稀释度设3个
3、重复，28培养箱中倒置培养3d4d。5.2.2溶磷、解钾菌的纯化挑取每个梯度的平板上有透明圈的菌落，并用1,2,3,4.，来标注，测量透明圈直径(D)、菌落直径(d),根据是否产生透明圈以及D/值大小来初步确定菌株的溶磷解钾能力的强弱。判定标准如下：解磷（钾）效果弱：0D/d1.0解磷（钾）效果中等：1.0D/d1.5解磷（钾）效果较强：1.5D/d3.0解磷（钾）效果强：D/d3.0将D/d1.5的菌落利用平板划线法分离纯化后，再用接种针挑取有明显透明圈的菌落，进一步通过平板划线法纯化，直至得到纯菌株后，转到牛肉膏蛋白胨斜面培养基（附录A5)上，保存于4冰箱中。5.2.3溶磷能力的测定在50
4、0mL三角瓶中分别装入100mL的PK0无机磷液体培养基（附录A2无琼脂）和100mL蒙金娜有机磷液体培养基（附录A3无琼脂），11高压灭菌30mi后备用。然后将溶磷圈法初筛得到的菌株接种到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，于28垶养：，挑取细菌接入到无菌水中，制成含菌量10个/mL的菌悬液，取1mL菌悬液，分别对应接种至PK0无机液？培养基和100L蒙金娜有机磷液体培养基，以培养基中加入1mL无菌水作为对照，每个处理3次重复，振荡培东(28，150rpm/min)5d。然后在4条件下对培养液进行离心(1000rpm/min)15min,吸取上清液，按L,Y/T1232-2015中4有效磷的测定方法测定上清液可溶性磷含量。5.2.4解钾能力的测定将在三角瓶中培养好的解钾细菌发酵液倒出，从中定容50mL,将发酵液在0rpm/min下离心10min,除去发酵液中的不溶性物质，然后取10mL菌液10000rpm/min离心10min,上清液中的钿含量测定按照Y/T889-2004中3.1的规定测定速效钾含量。测定菌体钾含量之前，先将菌体与残渣经碾钵充分撵磨，用10mL去离子水浸提，再用移液管吸取MmL上清液与4mL6mmo1/L的LiC1充分混匀，按照Y/T889-200M中3.1的规定测定速效钾含量。6肥效微生物的保藏3