1、中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（2）：305-313杂志网址：http:/高脂诱导下雄激素缺乏小型猪肾脏脂质沉积的关键基因表达分析*范莹盈1，任裕杰1，凌云2，吕东颖2，蔡兆伟1，2（1浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053；2浙江中医药大学中医药科学院动物实验研究中心，浙江 杭州 310053）摘要 目的：探讨高脂诱导条件下雄激素缺乏小型猪肾脏脂质沉积及关键基因表达的变化。方法：将雄性五指山小型猪随机分为3组，即不去势（IM）组、去势（CM）组和去势+睾酮（CMT）组，每组6只动物，均饲喂高脂饮食。12周后检测血
2、清肾功能指标，测定肾脏甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量；进行肾脏苏木精-伊红（H&E）和油红O染色，观察其脂质沉积和组织病理学变化。利用转录组测序分析肾脏组织表达谱差异，并用RT-qPCR和Western blot方法验证参与TG合成、胆汁酸代谢和雌激素合成相关差异表达基因。结果：CM小型猪肾脏重量明显低于IM和CMT小型猪（P0.05）；与IM组和CMT组小型猪相比，CM小型猪血尿素氮含量显著升高（P0.05），但血清肌酐和总蛋白水平没有显著变化；CM组小型猪肾脏内出现大量脂滴，且TG含量显著高于IM和CMT小型猪（P0.05）；与IM组和CMT组小型猪相比，CM组小型猪肾脏TG合成基
3、因包括固醇调节元件结合转录因子1（SREBF1）、糖类应答元件结合蛋白（ChREBP/MLXIPL）和硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）等表达升高，而胆汁酸代谢和雌激素合成基因包括法尼酯X受体（FXR/NR1H4）和雌激素受体1（ESR1）表达下调；睾酮处理能够逆转去势小型猪肾脏内脂质沉积及相关基因表达变化。结论：ESR1和NR1H4可能通过影响SREBF1脂质合成途径参与高脂诱导的雄激素缺乏小型猪肾脏脂质沉积过程。这为老年男性慢性肾脏疾病防治提供了新思路。关键词 肾脏；脂质沉积；雄激素缺乏；小型猪；高脂饮食中图分类号 R692；R363.2 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.
4、1000-4718.2023.02.013Analysis of key genes regulating renal lipid accumulation in testosterone-deficient miniature pigs fed with high-fat dietFAN Yingying1，REN Yujie1，LING Yun2，L Dongying2，CAI Zhaowei1，2（1School of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China；2La
5、boratory Animal Research Center，Academy of Chinese Medical Science，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China.E-mail：）ABSTRACT AIM：To investigate the effect of testosterone deficiency on renal lipid deposition and related gene expression in miniature pigs fed with high-fat diet.METHOD
6、S：Male Wuzhishan miniature pigs were randomly divided into 3 groups：intact male pigs（IM），castrated male pigs（CM）and castrated male pigs with testosterone replacement（CMT）.Six pigs in each group were fed with high-fat diet for 12 weeks.Serum renal function parameters and renal triglyceride（TG）and tot
7、al cholesterol（TC）levels were detected.Oil red O and HE staining was performed to observe lipid deposition and histopathological changes in the kidney.RNA-Seq technology was used to investigate the differential expression of transcriptome in the kidney.RT-qPCR and Western blot were used to verify th
8、e differentially expressed genes involved in TG synthesis，bile acid metabolism and estrogen synthesis.RESULTS：The kidney weight was significantly lower in CM group than IM group and CMT group（P0.05）.The content of blood urea nitrogen in CM group was increased compared with IM group and CMT group（P0.
9、05）.However，serum creatinine and total protein levels showed no significant difference.A large number of lipid droplets and significantly increased TG content in the kidney were observed 文章编号 1000-4718（2023）02-0305-09 收稿日期 2022-10-11 修回日期 2022-12-24*基金项目 浙江省基础公益研究计划项目（No.LGD22C040008）；浙江中医药大学自然科学青年探
10、索项目（No.2021JKZKTS008A）通讯作者 Tel：0571-86613782；E-mail：305in CM group compared with IM and CMT groups（P0.05）.Compared with IM group and CMT group，the expression of TG synthesis genes including sterol regulatory element binding transcription factor 1（SREBF1），carbohydrate-responsive element-binding prote
11、in（ChREBP/MLXIPL）and stearoyl-coenzyme A desaturase（SCD）was significantly increased in the kidneys of CM，while the expression of genes related to bile acid metabolism and estrogen synthesis including farnesoid X receptor（FXR/NR1H4）and estrogen receptor 1（ESR1）was significantly decreased.Testosterone
12、 replacement reversed the changes of lipid deposition and related gene expression in the kidneys of CM.CONCLUSION：The ESR1 and NR1H4 genes may be involved in the process of lipid deposition in the kidneys of CM fed with high-fat diet through influencing the SREBF1 lipid synthesis pathway.KEY WORDS k
13、idney；lipid deposition；androgen deficiency；miniature pigs；high-fat diet近年来，随着我国人口老龄化及人们生活方式的改变，慢性肾脏病的发病率逐年增加，已成为威胁人类特别是中老年身体健康的重要疾病。随着年龄的增长，中老年男性体内的雄激素水平会逐渐降低，易患肥胖、高胆固醇血症、糖尿病和动脉粥样硬化等疾病，这些均是导致肾脏脂质沉积并造成肾脏损害的独立风险因素1。尽管最近国内外有许多研究证实，雄激素水平降低可能是导致慢性肾病的主要内分泌紊乱2-3，但雄激素缺乏及其诱导的脂代谢紊乱对肾脏脂质沉积和功能的影响迄今仍未完全清楚。目前研究认为
14、，脂质合成增加在肾脏脂质沉积过程中起重要作用4。固醇调节元件结合蛋白 1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）是调节脂质代谢的关键核转录因子，参与调节甘油三酯和脂肪酸合成基因的表达，继而影响脂质代谢。有研究发现，高脂饮食能够上调C57BL/6J小鼠肾脏 SREBP-1c 及其下游脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）、硬脂酰辅酶 A 去饱和酶（stearoyl-coenzyme A desaturase，SCD）和乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl-coenzyme A carboxylase，
15、ACC）的表达，导致肾脏脂质沉积和肾小球硬化。进一步研究发现，SREBP-1c敲除小鼠能够抵抗高脂诱导的肾脏脂质沉积5。衰老过程中，肾脏脂质沉积也和SREBP-1c表达升高有关6。国内学者研究发现，SREBP-1c激活介导了糖尿病和高脂诱导的肾脏脂质沉积7-9。最近发现，脂肪酸氧化缺陷可能是造成老年小鼠肾脏脂质过度积聚的原因10。然而，雄激素缺乏诱导的肾脏脂质沉积相关基因表达变化却不清楚。本研究拟利用前期建立的雄激素缺乏调控高脂饮食诱导的小型猪模型，在此基础上检测血清肾功能指标、肾脏脂质含量以及组织病理学改变，同时进一步采用转录组测序（RNA-Seq）技术分析筛选雄激素缺乏诱导肾脏脂质沉积的关
16、键基因和途径，旨在从整体水平明确雄激素缺乏对高脂诱导的肾脏脂质沉积和功能的影响，为今后防治中老年男性慢性肾脏疾病提供新的靶点和治疗思路。材料和方法1实验动物与分组雄性五指山小型猪 18 只，体重（10.001.63）kg，由广东大华农动物保健品股份有限公司提供SCXK（粤）2013-0022，待适应性饲养34周后，将动物随机分为3组：不去势（intact male pigs，IM）组、去势（castrated male pigs，CM）组和去势+睾酮（castrated male pigs with testosterone replacement，CMT）组，每组6只。手术去势是在无菌和麻醉环境下将小型猪阴囊处切口后去除睾丸，不去势组小型猪进行伪手术处理，睾酮处理是在去势小型猪后腿外侧肌肉注射丙酸睾酮注射液（10 mg/kg，每周1次），具体方案见前期发表文献11-12。三组动物均饲喂高脂高胆固醇饲料，整个实验持续12周，结束后处死动物，迅速采集肾脏组织样本，置入液氮中速冻，随后保存在80 备用。2方法2.1血清生化指标检测分别在造模前 0周和造模后 4、8和 12周时，取小型猪前腔