1、收稿日期：；修订日期：基金项目：云南省重大科技专项计划（）；云南省中医药学分子生物学重点实验室项目（）；云南省科技厅科技计划（）；云南省中 医药学 分 子 生 物 学 重 点 实 验 室 开 放 课 题 基 金（）作者简介：侯 迥（），女（汉族），安徽阜阳人，云南中医药大学基础医学院在读硕士研究生，主要从事高脂血症、慢性阻塞性肺疾病等疾病的研究工作通讯作者简介：袁嘉丽（），女（回族），云南昆明人，云南中医药大学教授，博士学位，主要从事中西医结合调节人体微生态平衡防治疾病研究工作葛根素抑制 信号通路调节小鼠高脂血症的实验研究侯 迥，张 童，李 蕾，张思琪，文 静，羊忠山，袁嘉丽，（云南中医药大学
2、基础医学院，云南 昆明；云南省中医药学分子生物学重点实验室 云南中医药大学，云南 昆明；云南中医学院中医药调节人体微生态省创新团队 云南中医药大学，云南 昆明）摘要：目的 探究葛根素对高脂血症（，）模型小鼠的作用效果及其作用机制。方法 小鼠随机分为对照组（）、模型组（）、葛根素治疗组（）。除对照组外另两组通过喂食高脂饲料建立 模型。葛根素治疗组分别给予低（）、中（）、高（）剂量葛根素灌胃，对照组和模型组灌胃等量生理盐水。通过病理切片观察小鼠肝脏变化；检测肝组织中脂蛋白脂酶（）、脂肪酸合成酶（）、固醇调节元件结合蛋白（）的 相对表达量；检测肝组织中类磷脂酰肌醇 激酶（）蛋白激酶（）雷帕霉素靶体蛋
3、白（）信号通路蛋白磷酸化表达水平。结果 与模型组相比，葛根素组小鼠肝组织细胞空泡样改变和脂滴明显减少，血清总胆固醇（）、低密度脂蛋白胆固醇（）显著降低，高密度脂蛋白胆固醇（）明显升高；相对表达量升高（），、相对表达量降低（），并且在葛根素干预后，小鼠肝脏组织、蛋白磷酸化水平降低（）。结论 葛根素可降低血清、水平，升高 水平，调节，其作用机制可能是通过抑制 信号通路调节高脂血症。关键词：高脂血症；葛根素；信号通路；药食同源 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）高脂血症（，）是一种以血脂水平异常为特征的代谢紊乱疾病。临床上把总胆固醇、血清甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白等作为高脂血症的
4、主要检测指标。高脂血症是脂质过氧化水平增高的重要因素之一，其发生发展可能引发动脉粥样硬化、缺血性脑卒中或糖尿病等疾病。近年来，成人高脂血症患者不断增加，因此，加强 治疗相关的实验研究，对降低 相关并发症、提高患者生活质量等具有重要意义。葛根始载于神农本草经：“葛根，味甘平。主治消渴，身大热，呕吐 ”，为豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根。葛根素是从豆科植物野葛或甘葛藤根中所提取出的一种黄酮苷，其化学名为，二羟基 葡萄糖醛基异黄酮，是葛根的主要有效成分之一。现代研究表明，葛根提取物及葛根素可以抑制肝脏脂肪生成，提高肝脏抗氧化活性，减少脂质在体内的沉积从而治疗高脂血症。在脂质代谢的进程中，类磷脂酰肌醇
5、激酶（）蛋白激酶（）雷帕霉素靶体蛋白（）信号通路能够影响脂肪酸的合成。通路具有调控细胞增殖、凋亡、新陈代谢的功能。是一个独特的酶家族成员，负责蛋白质的磷酸化，而且对胰岛素功能有重要作用。是一种丝氨酸 苏氨酸激酶，调节多个下游信号分子，其还参与多种细胞功能的实现，如细胞的生存、增殖和蛋白质合成等。激活多个下游靶点，效果最明显的是 途径，肥胖严重程度增加时，被明显激活。研究表明，通路与脂代谢关系密切，通过调节下游脂代谢相关基因的表达干预脂质的稳定。激活该通路增加了脂肪生成相关内基因脂肪酸合成酶的 表达水平，从而促进脂肪的生成。等发现，抑制 通路活化能够调节高脂血症。通路可通过胰岛素信号转导调节 转
6、录因子诱导脂肪酸和胆固醇的合成。肝脏固醇调节元件结合蛋白 （，）表达增加会促进脂肪酸和甘油三酯的合成，增加细胞内脂质的含量，产生脂毒性。脂肪酸合成酶（，）是 调控的下游靶基因，影响脂肪氧化。在脂肪酸合成中起关键作用，脂肪异位分布、脂肪炎性反应及胰岛素敏感性降低都与 过度表达有关。脂蛋白脂酶（，）能有效将甘油三酯分解成游离脂肪酸和甘油，并促使脂蛋白之间转移，因此，上调 的表达能调节血浆脂蛋白中的脂质代谢。我们前期研究发现，葛根素能降低血清中、水平，升高 水平从而干预 发展进程。本实验探究葛根素能否通过抑制 信号通路，调节脂代谢基因，从而调节高脂血症。材料与仪器 实实验验动动物物 雄性小鼠 只，体
7、重 ，购于成都达硕实验动物有限公司，实验动物许可证编号：（滇），饲养在云南中医药大学 级动物房，平均温度（），光照时间，自由饮食饮水，所有小鼠实验均经云南中医药大学动物伦理实验委员会批准并按照其指导方针进行。药药物物 葛根素批号：，纯度：，规格：，货号：，购于成都德思特生物技术有限公司。造造模模饲饲料料 高脂饲料（成分：脂肪，蛋白质，糖类；，美国 公司）；对照饲料（成分：脂肪，蛋白质，糖类；，美国 公司）。试试剂剂与与试试剂剂盒盒 总胆固醇（）测试盒（货号：）、高密度脂蛋白胆固醇（）测试盒（货号：）、时珍国医国药 年第 卷第 期 低密度脂蛋白胆固醇（）测试盒（货号：），购于南京建成生物工程研究
8、所；（型，公司）；山羊抗兔 （批号：，公司）；山羊抗鼠 （批号：，公司）；（货号：，公司）；（货号：，公司）；（货号：，公司）。主主要要仪仪器器 多功能全波段酶标仪（美国伯滕仪器有限公司）；高速冷冻离心机（，）；组织研磨仪（）；实时荧光定量 仪（公司）；凝胶成像系统（基因有限公司）；专业化学发光成像系统（公司）。方法 分分组组、造造模模及及给给药药 使用随机数字表法将 只 小鼠选取 只构建 模型，剩余 只作为对照组。采用高脂饲料喂养 周建立 模型。造模结束后，将 只 小鼠随机分为 组，分别是模型组、葛根素低剂量组（）、葛根素中剂量组（）和葛根素高剂量组（），每组 只。造模完成第 天给药干预，对
9、照组、模型组用 注射液 灌胃，葛根素低、中、高剂量组分别拟给予对应剂量葛根素 （、），每天 次，各组均连续灌胃。检检测测指指标标及及方方法法 病病理理切切片片观观察察肝肝脏脏组组织织脂脂滴滴沉沉积积 药物干预 天后处死小鼠，取材，使用多聚甲醛固定肝脏组织，脱水、包埋冰冻后进行 染色和油红 染色，观察肝脏组织炎症、脂滴沉积和形态学变化。检检测测血血脂脂水水平平 末次给药后禁食禁水，取血后离心得到小鼠血清，使用试剂盒检测血清、水平，严格按照试剂盒说明书操作。检检测测 称取 肝脏组织充分研磨，使用 蛋白测定法检测蛋白含量确定上样量，制胶上样电泳，转膜后脱脂奶粉封闭，加入一抗 过夜，洗膜，二抗孵育，再
10、次洗膜，加 发光液拍照，分析图像。检检测测 称取 肝脏组织，充分研磨后提取，去除基因组，逆转录得到 文库，在冰上使用 预混液在实时 系统（）上根据说明书进行实验，使用比较 法（）来确定基因表达，对照组为 。引物购于 公司设计合成，序列见表。表 、引物序列基因名称物种来源（）小鼠 小鼠 小鼠 小鼠 统统计计方方法法 使用 统计软件进行统计分析，采用 方法进行组间两两比较，计量资料以?表示，计数资料采用秩和检验。为其差异没有统计学意义；，表明其差异有统计学意义。结果 各各组组小小鼠鼠肝肝脏脏组组织织变变化化 通过肝脏组织 染色，与对照组相比，模型组肝小叶有明显空泡样改变，肝细胞变性明显，且有明显炎
11、性细胞浸润；葛根素组治疗 天后，各治疗组肝小叶较为完整，空泡样改变减少，肝脏脂肪变性程度减轻，脂滴减少，炎性细胞浸润减轻且高剂量组最为明显，偶见肝细胞脂肪变性（见图）。肝脏组织油红 染色发现，与对照组相比，模型组出现明显的肝脏脂肪变性、脂质堆积，细胞核被明显挤压；药物干预 天后，肝脏脂质堆积减轻、脂肪细胞减少，高剂量组较为明显（见图）。图 小鼠肝组织切片（染色）图 小鼠肝组织切片（油红 染色）时珍国医国药 年第 卷第 期 各各组组小小鼠鼠血血脂脂水水平平变变化化 与对照组相比，模型组 和 水平显著升高（），水平明显降低（）；经葛根素治疗 天后，和 水平降低（），水平升高（）。上述结果表明，此次
12、试验造模成功，且葛根素（、）可调剂 且呈与剂量相关，浓度的干预效果最佳，因此选择 剂量组进行机制探索（见表、图）。表 各组小鼠血脂变化情况（?）组别 对照组 模型组 葛根素低剂量组 葛根素中剂量组 葛根素高剂量组 与对照组比较，；与模型组比较，；与对照组比较，；与模型组比较，图 各组小鼠血清中、的表达水平 各各组组小小鼠鼠肝肝脏脏组组织织 通通路路蛋蛋白白表表达达量量变变化化 信号通路在 进程中发挥了重要作用，通过检测、蛋白磷酸化水平发现，模型小鼠肝组织中、蛋白磷酸化水平显著升高（）；葛根素治疗 天后，、蛋白磷酸化水平明显降低（），说明葛根素通过抑制 信号通路调节（见表、图、图）。表 、和 蛋
13、白的相对表达水平（?）组别 对照组 模型组 葛根素组 ，磷酸化类磷脂酰肌醇 激酶；、，磷酸化蛋白激酶；，磷酸化雷帕霉素靶体蛋白；与对照组比较，；与模型组比较，；各各组组小小鼠鼠肝肝脏脏组组织织 、表表达达含含量量变变化化 、和 是脂代谢过程中的关键基因，检测、和 对高脂血症研究有重要意义。通过检测 、指标发现，模型小鼠肝组织中 相对表达水平明显降低（），、表达量明显升高（），葛根素干预 天后 相对表达水平明显升高（），、表达量明显降低（），表明葛根素组是通过 、三种脂代谢基因调节高脂血症。见表、图。对照组；模型组；葛根素组图 各组小鼠肝组织中 、和 蛋白的表达水平与对照组相比，；与模型组相比，
14、图 、和 蛋白的相对表达水平表 各组小鼠肝组织、的相对表达量（?）组别 对照组 模型组 葛根素组 ，脂蛋白脂酶；，脂肪酸合成酶；，固醇调节元件结合蛋白；与对照组比较，；与模型组比较，；讨论随着生活方式的改变，高脂血症已成为常见病理现象，其可能会导致肥胖、糖尿病和心血管疾病等，临床常用他汀类和贝特类等作为治疗高脂血症的首选药物，但他汀类药物治疗可能会有潜在不良反应和药物依赖性的限制，部分患者使用贝特类药物后出现恶心、呕吐等胃肠道不适，甚至会出现横纹肌溶解。因此，在高脂血症未发展成更严重的疾病之前，可通过药食同源的药物进行调节，阻断高脂血症的发展。血脂水平异常是高脂血症的主要特点，、的水平直接反映
15、血脂水平异常程度。在本次实验中，相比对照组，模型组、升高（），降低（），葛根素干预后，给药组、降低（），升高（），说明葛根素有调节血脂水平异常的功效。时珍国医国药 年第 卷第 期 与对照组比较，；与模型组比较，图 各组小鼠肝组织、的相对表达量 通路在细胞凋亡、细胞运动和细胞增殖等方面都起到了很大的作用，抑制 通路蛋白磷酸化水平对高脂血症有调节效果。在本实验中，结果表明，高剂量给药组的 通路磷酸化水平均比模型组低，说明葛根素抑制了 通路磷酸化。是一种生脂转录因子，介导脂质稳态，促进 基因的转录从而增加甘油三酯在体内的沉积。在本实验中，实验结果显示，模型组 和 表达均显著上升（），给药后表达量下降
16、（），提示葛根素可能通过降低 和 的表达降低血脂。可以水解甘油三酯，因此，提高 表达水平可以加快脂质代谢，这一点在本实验中得到了证实，相对于模型组，给药组 表达显著上升（）。综上，葛根素可抑制 信号通路激活脂代谢基因调节高脂饲料诱导的 小鼠，这一实验结果可能为中医药寻求多靶点治疗高脂血症提供理论依据，同时为中医药防治亚健康提供新的思路。参考文献：，（）：，：诸骏仁，高润霖，赵水平，等 中国成人血脂异常防治指南（年修订版）中华健康管理学杂志，（）：杨新颖 葛根素药理活性研究进展 科学技术创新，（）：（）：，：陈 垚，卢连华，高景芳，等 葛根、山楂、绞股蓝的提取物与红曲米合用降血脂作用研究 预防医学论坛，（）：高云飞，杨国元，贾连群，等 丹参酮 调控 通路对高脂血症大鼠肝脏自噬的影响 中华中医药学刊，（）：吴子鑫，吴申伟 信号通路及其与乳腺癌关系的研究进展 山东医药，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：金传阳 麦粒灸通过 信号通路下调 改善高脂血症大鼠肝脏脂质代谢 南京中医药大学硕士学位论文，（）：王 琪 对青春期大鼠脂代谢的影响 吉林大学硕士学位论文，李知行，张