1、安徽科技学院学报，（）：收稿日期：基金项目：安徽省高校自然科学研究重点项目（）；安徽中医药高等专科学校自然科学研究重点项目（）；安徽省教师教学创新团队 项 目（）；安 徽 省 教 学 示 范 课（皖 教 秘 高 号）；安 徽 省 课 程 思 政 示 范 课 程（）。作者简介：朱丹（），女，安徽枞阳人，硕士，教授，主要从事药用植物生理生化研究。高温胁迫诱导薄荷差异表达基因的分析朱丹，秦亚东，李林华，高焕（安徽中医药高等专科学校，安徽 芜湖 ；安徽师范大学，安徽 芜湖 ）摘要：目的：分析薄荷幼苗高温胁迫下的差异基因表达情况，从中挖掘薄荷幼苗的耐热功能基因，为薄荷幼苗的抗逆机制提供生物信息学依据。方
2、法：以水培薄荷为研究对象，分别进行高温胁迫（对照，）、（，）和（，）的种处理，然后进行转录组测序，对比分析筛选出高温胁迫应答的基因，并对部分基因利用实时荧光定量 （）进行验证。结果：和 的共同差异表达基因（，）有 个，其中上调基因 个，下调基因 个。对共有 进行 功能富集分析，以对值矫正后的 为阈值，得出 条 功能组为显著富集，主要体现在生物过程（，）方面，包括活性氧反应、对刺激的反应、热反应等；功能富集分析得出，共有 个 映射到 条通路当中，主要涉及代谢途径、内质网中的蛋白质加工、核糖体、次级代谢产物的生物合成等方面。进一步挖掘响应和的共有 中，上调的有 个 家族的基因，主要包括 个 基因，
3、个 基因和个 基因等；另有个转录因子 、亦显示上调。利用 对测序数据进行验证，基因的表达趋势与转录组测序结果一致，证明测序结果真实可靠。结论：薄荷通过启动活性氧代谢或氧化应激等生物进程来响应高温胁迫，并通过内质网中的蛋白质加工等途径来抵御高温伤害。上调热激蛋白 、等基因和 、等个转录因子家族的相关基因，对薄荷的耐热调控具有积极意义。关键词：薄荷；高温胁迫；转录组分析；热激蛋白；转录因子中图分类号：文献标志码：文章编号：（）开放科学（资源服务）标识码（）：，（，；，）：，：（，），（，）（，），：（）（）（），（，），（），：，：；薄荷（）作为一种中药材，可全草入药，本草纲目 记载：“薄荷辛能发
4、散，凉能清利，专用于消风散热，利咽喉口齿诸病”。现代药理学研究表明，薄荷具有抗炎、抗真菌、抗肿瘤、抗氧化、抗辐射等多种作用。作为药食两用的植物，薄荷在日常生活中已经广泛应用于制药、护肤品、食品等多个领域。随着全球气候的不断变暖，高温胁迫已成为绝大多数植物生长发育需要面临的重大挑战，关于农林作物的耐热机制已成为近年来国内外植物科学研究的热点之一，而对于药用薄荷的研究多集中在本草考证、主要化学成分以及药理功效等方面，关于薄荷响应高温胁迫下的机制特别是分子水平上的研究尚未见报道。因此，深入研究薄荷的耐热调控机制对于提高薄荷抗逆性和优良品种选育等方面都有着重要的现实意义。近年来，人们利用高通量技术测定
5、生物体内特定组织或细胞、特定时间点或特定条件下的转录情况，可以揭示植物响应环境胁迫下的应答机制。与此同时，药用植物基因组信息较为匮乏，转录组测序技术（）可以在无需参考基因组的情况下进行，并且可以覆盖全部转录本，这对于药用植物抗逆功能基因的挖掘十分有利。为适应高温环境，植物在长期进化过程中形成了一定的抗逆机制，已有多种农作物、观赏植物和瓜果蔬菜中的耐热调控机制依托高通量测序技术被揭示。李川等研究了郑单 和先玉 玉米品种花粒期在高温胁迫和 的差异基因表达情况，结果表明不同基因型、不同高温胁迫时间对玉米基因表达情况有很大影响。陈雪倩等发现在 的高温处理下华北型黄瓜品种“”幼苗的差异表达基因中 、和
6、可能在黄瓜热应激反应中发挥正向调节功能，、和 类转录因子也受热胁迫诱导而提高。郝力慧等以牡丹品种“羽红”为研究对象，通过对 高温胁迫处理后的叶片进行转录组测序，发现 基因可在短期内迅速响应高温胁迫并参与牡丹的耐热调控的结论。利用高通量测序技术研究高温胁迫下薄荷幼苗的响应机制，为揭示药用植第 卷第期朱丹，等：高温胁迫诱导薄荷差异表达基因的分析物薄荷抵御热伤害提供了新方法、新路径。本研究采用实验室模拟高温胁迫的方式，对 高温胁迫下的薄荷幼苗进行转录组分析，研究薄荷幼苗在不同胁迫时段的差异基因表达情况，挖掘薄荷幼苗耐热功能基因，为薄荷幼苗抵御高温胁迫伤害提供生物信息学依据。材料与方法 供试材料从安徽
7、中医药高等专科学校药苑选取生长良好、性状一致的薄荷作为试验材料，剪下 枝条，清理下方叶片，将茎端洗脱后放至 营养液中进行水培。光照培养箱设置光照强度 （）、光周期 （昼 夜）、温度 （昼夜）、。待薄荷第片新叶完全展开后随机挑选株薄荷幼苗作为个生物学重复，分别进行、的 高温处理，各处理均设置个生物学重复。将处理后的新叶幼苗于液氮中冷冻并储存于 备用。项目测定及分析方法 提取使用 公司 试剂盒从薄荷叶片组织中提取总 ，经过 法、法和琼脂糖凝胶电泳法检测合格后，委托上海凌恩生物科技有限公司进行转录组测序。测序数据质控、分析与功能注释利用 软件对原始数据（）进行过滤，去除测序接头序列、序列末端质量较低
8、（质量值小于）、含 比例超过、长度小于 的序列，得到高质量的质控数据（）。利用 软件对 进行从头组装、拼接、比对，针对拼接得到的 序列，使用 软件分别与、等数据库进行比对，从而获得预测基因的注释信息。共有差异表达基因分析以基因组的注释文件为参考，统计每个转录本的 值，以此作为该转录本的表达量。用 软件（显著差异基因转录本筛选条件为：）分别分析得出高温胁迫与（）间的差异基因，以及高温胁迫与（）间的差异基因，通过维恩分析，找出两者之间的共同差异表达基因，采用软件 （：）进行富集分析，利用软件 （：）进行 富集分析。实时荧光定量 验证为验证转录组测序结果，挑选个基因进行验证，采用 方法，利用 软件设
9、计引物，内参为。结果与分析 测序数据质量评估试验设置、个处理，每个处理设置个生物学重复，共建立个 文库。经过 测序后，得到个处理下的组薄荷幼苗的原始数据和质控数据，其中 值大于、值大于 和 含量大于（表），能满足后续的基因功能注释和分析要求。表转录组数据质量分析 样品名称原始数据质控数据 含量对照 对照 对照 高温 高温 高温 高温 高温 高温 注：、分别表示 数值大于、的碱基占总体碱基的百分比；含量指碱基 和的数量和占总的碱基数量的比例。安徽科技学院学报 年对 进行从头组装，得到 个 ，总 长度为 ，总的转录本数量为 ，总的转录本的长度为 ，的平均长度 ，最长 的长度为 ，为 。将质控后得到
10、的高质量测序序列与拼接结果进行比对，比对率均为 以上（表）。表比对率统计表 样品名称质控数据比对数据比对率对照 对照 对照 高温 高温 高温 高温 高温 高温 将组装的序列分别与、等数据库进行比对，对应 个总基因，获得注释 信息分别为 、个，分别占总基因数的 、（表）。表基因功能注释统计表 数据库注释基因占比在 数据库中得到注释 在 数据库中得到注释 在 数据库中得到注释 在 数据库中得到注释 在 数据库中得到注释 在所有数据库中得到注释 至少在一个数据库中得到注释 差异基因表达分析表显示，按 筛选的条件，得到高温胁迫的 总数为 ，包括上调表达的 个和下调表达的 个；而高温胁迫的 总数只有 个
11、，上调表达的 个、下调表达的 个。说明高温胁迫差异基因表达以上调为主。将高温胁迫的 与高温胁迫的 进行维恩分析（图），得出响应高温胁迫、的共同的 为 个，上调数为 个，下调数为 个。表差异基因表达信息统计（）（）比较组合差异基因总数差异基因上调数差异基因下调数高温 对照 高温 对照 图高温胁迫和差异表达基因维恩图第 卷第期朱丹，等：高温胁迫诱导薄荷差异表达基因的分析 共同差异表达基因的 功能富集分析富集分析 个共同 ，共映射到 条 中，用 多重检验法对值进行校验后（），共得出 条 为显著富集，其中在生物过程（，）方面显著富集最多，共计 条；在分子功能（，）方面和细胞组成（，）方面显著富集较少，
12、分别为和条。表显示的是 显著富集的前 条（值均为零），均表现为 方面，大部分与胁迫有关，差异基因数量 个以上的，如对刺激的反应（：，个 ，）、胁迫反应（：，个，）、非生物刺激的反应（：，个 ，）、外部刺激的反应（：，个 ，）；一部分与温度有关，如对温度刺激的反应（：，个 ，）、热反应（：，个 ，）；还有一部分与氧的代谢有关，如对含氧化合物的反应（：，个 ，）、氧化应激的反应（：，个 ，）、活性氧反应（：，个 ，）、过氧化氢的反应（：，个 ，）等。表共同差异表达基因的 功能富集分析（前 条）（）功能组功能描述差异基因数量总差异基因数量占比：对刺激的反应 ：胁迫反应 ：对非生物刺激的反应 ：对外部
13、刺激的反应 ：对含氧化合物的反应 ：对无机物的反应 ：对温度刺激的反应 ：对氧化应激的反应 ：热反应 ：对有毒物质的反应 ：对抗生素的反应 ：活性氧反应 ：对过氧化氢的反应 ：对高光强度的反应 共同差异表达基因的 富集分析 富集分析共同 个 的结果表明，共有 个 可注释到 条通路当中。表显示，富集通路中差异基因为 个以上的，代谢途径（，个 ）差异基因数量最多，其次是内质网中的蛋白质加工（，个 ）、核糖体（，个 ）、次级代谢产物的生物合成（，个 ）。用 多重检验法对值进行校验后，以 为显著富集条件，筛选出响应 和 的共有差异基因显著富集的 通路，表中用星号（）标注，即内质网中的蛋白质加工（，个
14、）、抗原处理和呈递（，个 ）、雌激素信号通路（，个 ）等。耐热候选基因分析对和共同上调的 个 进行分析，筛选到 个 基因家族的耐热基因。表显示，小热激蛋白 数量最多（个），其次是热休克蛋白 （个）、（个），且 差异倍数（）大于（）组。它们可能在薄荷应对高温胁迫时起到积极应对作用。安徽科技学院学报 年表共同差异表达基因的 富集分析（前 条）（）分类号第三层级通路描述该通路下差异基因个数该通路下注释基因的个数 代谢途径 内质网中的蛋白质加工 核糖体 次级代谢产物的生物合成 抗原处理和呈递 雌激素信号通路 生热作用 坏死性凋亡 信号通路 长寿调节途径多物种 氧化磷酸化 内吞作用 植物病原相互作用 剪
15、接体 信号通路 表共同差异基因表达的上调热激蛋白基因 基因 （）（）热激蛋白家族 、转录因子在植物响应高温胁迫时也具有重要的作用。对同时响应高温胁迫、的共同差异表达基因进行分析，得出 个共有差异转录因子，其中上调数个，分别为 、家族。第 卷第期朱丹，等：高温胁迫诱导薄荷差异表达基因的分析表共同差异基因表达的转录因子 基因编号转录因子家族类型调控 实时荧光定量 验证为验证转录组测序结果，从共同响应高温胁迫、的 个热激蛋白基因和 个转录因子中随机挑选个基因进行荧光定量 验证。引物设计见表。图显示，个基因的表达趋势与转录组测序结果一致。说明本研究 测序结果分析可靠。表 反应所需引物 序号引物名称（为
16、上游引物，为下游引物）引物序列（）内参 图部分基因的差异表达分析 安徽科技学院学报 年结论与讨论高温胁迫下，一方面，植物能通过感知环境信号转导引起生理生化指标、激素、基因表达、代谢、表型等方面的特异反应。另一方面，植物也会通过一系列的应激反应来建立抗逆机制以便保护自身。本研究通过高通量转录组测序技术，发现相比较响应高温胁迫的 ，大部分薄荷幼苗的差异表达基因在高温胁迫（个 ）时就可以表达出来，将高温胁迫下的、相对于对照的差异基因进行了维恩分析，发现有 个共同 ，说明这些基因既可以响应较短时间的高温胁迫（），也可以响应较长时间的高温胁迫（），它们对于高温胁迫下的薄荷幼苗的响应机制具有更为积极的研究价值。进一步分析发现，个共有 主要显著富集在各种生物过程（）方面，大部分与高温（：，个 ）、刺激（：，个 ）、胁迫（：，个 ）等有关，这与实验研究中的高温胁迫条件是吻合的。值得注意的是，在共同差异表达基因的前 条 功能富集条目中，有不少与活性氧代谢或氧化应激反应（：，个 ；：，个 ；：，个 ；：，个 ）有关。活性氧被认为是信号转导因子，介导各种胁迫条件下的信号转导过程，它的积极作用在于激活胁迫条件