1、 第四章第四章 动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养 (Animal Cell and Tissue Culture)动物体内取出组织和细胞，在体外模拟机体内的生理 条件，建立无菌、适温和一定的营养条件，使之生长 和生存，并维持其结构和功能的技术，称动物细胞与 组织培养。是动物细胞工程的重要技术基础：细胞融合、组织 工程、胚胎工程、干细胞工程、动物克隆、动物细胞 产品的大规模制备技术等等都离不开。4.1 概概 述述 4.1.1 发展历史发展历史 4.1.2 动物细胞的特点动物细胞的特点 4.1.3 动物细胞与组织培养的概念动物细胞与组织培养的概念 4.1.4 动物细胞的体外培养生长特性动物细胞
2、的体外培养生长特性 4.1.1 发展历史 1、动物细胞（组织）培养技术的起源：19世纪所应用的胚胎学技术。动物细胞培养的奠基人：美国生物学家哈里森（1907年）用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将 蛙胚神经组织培养在淋巴液中，存活几周，有细 胞突起的生长过程。先驱者中法国学者卡勒尔：设计卡氏培养瓶自 1923年用于培养鸡胚的心肌组织成功以后，已使 多种动物组织培养获得成功。4.1.1 发展历史 2、20世纪40年代以后：动物组织培养的科学家们研究重点集中在培养 基方面。3、20世纪80年代以后：随着基因工程技术和细胞融合技术的迅速发 展，已能把特定的外源基因通过PCR技术扩增几 千倍，并可转染到细
3、胞内，使其得到高质量的表 达。4.1.1 发展历史 4、近年：淋巴细胞杂交瘤技术，使动物细胞培养进入了 一个新领域。杂交瘤细胞能在体外悬浮情况下大 量繁殖并产生单克隆抗体。随着基因重组和单克隆抗体技术的发展，动物 细胞组织培养展现出越来越可观的工业化前景。4.1.2 动物细胞的特点动物细胞的特点（一）动物细胞之间的连接特点：1.紧密连接：牢固、无间隙。2.间隙连接：2-3nm间隙。3.隔壁连接：20-30nm间隔，有横隔。4.中间连接：无横隔、透明，间隔20-30nm。5.桥粒连接：有间隙，有纤维形成的特殊结构。4.1.2 动物细胞的特点动物细胞的特点（二）动物细胞的培养特点：1.动物细胞比微
4、生物细胞大，无细胞壁。2.动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易受污染。3.培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。4.动物细胞间主要以聚集体形式存在。5.原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。4.1.3 动物细胞与组织培养的概念动物细胞与组织培养的概念 动物细胞与组织培养：从动物体内取出 细胞或组织，模拟体内的生理环境条件，在无菌、适宜温度和丰富营养条件下，使 离体细胞或组织生存、生长并维持结构和 功能的一门技术。是动物细胞工程的重要技术基础。4.1.4体外培养细胞的分型体外培养细胞的分型 贴附和非贴附生长：1.贴附型细胞：细胞间相互接触；细胞与细胞外基 质（培养器皿壁或载体）结合。多数细胞属贴
5、附型细 胞。2.非贴附型细胞：此类细胞体外生长不必贴壁，可 在培养液中悬浮生长。如：白细胞、淋巴细胞，肿瘤 细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等。贴附型细胞贴附型细胞(anchorage-dependent cell)哺乳动物大多数细胞必须附着固体表面生长。当细胞布满表 面（单层）时，即停止生长。若取走一片细胞，存留的细胞就 会沿着表面生长而重新布满表面。从生长表面脱落而进入液体 的细胞通常不再生长而逐渐退化。（为单层附壁培养）按培养细胞的形态，可分四类：1.成纤维型细胞(fibroblast)外形与体内成纤维细胞相似，梭形或不规则形。细胞贴壁后呈梭形，胞质外伸出2-3个长短不同的突起，成 放射状，
6、胞间疏松。起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为这种形式。贴附型细胞贴附型细胞 2.上皮型细胞(epithelium)：泛指形状上类似上皮细胞的细胞。特点：扁平状，形态较为规则。胞间紧密，单层贴壁。起源于内、外 胚层的细胞体外培养时如此。3.游走型细胞(wandering)：类似巨噬细胞样的特征。外形不规则。分散生长，不连接成片，成群落；通常伸出伪足和 突起，贴壁位置不固定，呈活跃的游走和变形运动。单核巨噬细胞系细胞体外培养常如此：颗粒性白细 胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞。贴附型细胞贴附型细胞 4.多形型细胞(polymorphic)：形态上不规则（难以确定其形态）的细胞。细胞
7、胞体略呈多角形；细胞胞突细长形；类 似丝状伪足。如神经元和神经胶质细胞 影响细胞形态的主要因素 细胞的来源不同；生理条件不同，功能状态不同；血清成分、培养基成分、添加成分、培养基的酸碱 度、气象环境、温度等不同。如HeLa细胞原本是一种上皮型癌细胞，但若在过酸 或过碱的条件下培养，可以呈现梭形，当酸碱适中时 又可以恢复上皮型特征。非贴附型细胞或悬浮型细胞非贴附型细胞或悬浮型细胞（suspend cell）此类细胞体外生长不必贴壁，可在培养液中 悬浮生长。如：白细胞、淋巴细胞，肿瘤细胞 和杂交瘤细胞以及转化细胞系等。形态：始终为球状 优点：细胞密度高，培养效率高，易操作控 制，便于大规模生长。有
8、些细胞既可悬浮，也可以贴附。4.1.5 体外培养细胞的生长特性体外培养细胞的生长特性 1、贴附：细胞接种后很快形成伪足，与底物点接触，细 胞逐渐呈放射状伸展，细胞体中心变扁平状。影响因素：低钙不利于细胞伸展；低温和培养 液流动过快妨碍贴附；生物因素：表皮生长因子（刺激神经胶质细胞的皱褶活动）、成纤维细胞生 长因子（减少3T3细胞的扁平度）。4.1.5 体外培养细胞的生长特性体外培养细胞的生长特性 2、接触抑制（contact inhibition）：正常细胞移动、靠近而接触时，细胞不再移动且 停止接触区质膜的皱褶活动和细胞运动以及细胞的 重叠生长。肿瘤（癌）细胞无此现象。3、密度抑制（dens
9、ity inhibition）：只要营养充分，接触抑制的细胞仍能分裂增殖。但细胞密度进一步加大、营养减少、代谢产物增多 时，（因营养和代谢物的影响）细胞分裂停止，出 现接触抑制。4.1.6 体外培养细胞的生长与增殖过程体外培养细胞的生长与增殖过程 4.1.6.1、细胞系的生长过程：培养的细胞持续生长的时间有限，最终自行停止生 长。细胞的种类、性状、原供体的年龄决定其生存时 间长短。如：人胚成纤维细胞存活一年、传3050代相当于 150300个细胞周期）；供体是成体或衰老个体时则 存活更短；肝、肾细胞仅能传几代或十几代。获永生性或恶性转化（遗传性改变）生存期则发生 变化。4.1.6.1 细胞系的
10、生长过程：细胞系的生长过程：1、原代培养期（primary culture phage)：从取出 体内组织接种培养到第一次传代的时期。14周。细胞：移动活跃、分裂但不旺盛、相似于（也能 代表）体内组织、药物测试的好对象。2、传代期（passage phase）：原代细胞生长一 定时间后，将其分开接种到多个培养瓶中继续培养的 过程称传代。细胞系（cell line）：传代细胞分裂增殖旺盛、能 保持一致的二倍体核型，称细胞系。细胞的代数=转 接的次数。每一代中细胞分裂36次。4.1.6.1 细胞系的生长过程：细胞系的生长过程：3、衰亡期（senescence phase）：细胞仍生存，但 不增殖或
11、增殖很慢，最后衰退死亡。细胞可发生自发 转化，其标志之一：获永久增殖能力而成连续细胞系（株）。连续细胞系（株）：主要发生在传代期。细胞系（cell line）：第一次传代培养后的细胞。细胞株（cell strain）：在经过生物学鉴定的细胞系 中，通过单细胞培养或筛选法，由单细胞增殖形成的 细胞群。亚株（substrain）：？体 外 培 养 细 胞 系 的 生 长 曲 线 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 t周 接种培养 第一次传代 衰老 死亡 传 代 期 细 胞 系 连续细胞系 原代 培养 转化 传代间隔 细 胞 浓 度 的 指 数 4.1.6.2 每代（群体）细胞的生长过
12、程每代（群体）细胞的生长过程 每代细胞要经过四个生长阶段：1、潜伏期（latent phase）：接种悬浮贴附不马上分裂（潜伏）。原（初）代培养细胞：2496 h；传代和肿瘤细胞：624 h。2、对数生长期（logarthmic growth phase）：分裂旺盛、分裂相增多（其数量标志分裂的旺盛程 度）。细胞分裂指数（mitotic index,MI）:MI=(分裂相个数1000个细胞)100%。初代MI 低，传代和肿瘤细胞系MI高达35%。4.1.6.2 每代（群体）细胞的生长过程每代（群体）细胞的生长过程 在理想的环境下，细胞处于较恒定的生长分裂状 况，其生长速率：dN dt N （N
13、时间 t 时的细胞个数；细胞比生长速率：在对数生 长期，群体细胞数增殖一倍所需要的时间，以时间T 表示）积分得：T 2 (时间T表示细胞比生长 速率)此时期细胞以指数形式增长繁殖。持续35天。4.1.6.2 每代（群体）细胞的生长过程每代（群体）细胞的生长过程 3、稳定期（stationary phase）：因培养空间和营 养物质有限，特别是代谢废物的累积，细胞进入：新 分裂的细胞数与死亡的细胞数相等的动态平衡时期。细胞数不增加，但代谢还是活跃的。4、衰亡期（senescence）：营养物的耗尽和有害 物质的作用，细胞死亡数大于细胞分裂数。最高分裂次数限制：正常细胞都有，肿瘤（癌）细 胞没有。
14、细胞浓度的对数 潜伏期 对数生长期 稳定期 衰亡期 0 24 48 72 96 120 h 每代（群体）细胞生长的四个时期每代（群体）细胞生长的四个时期 4.2 动物细胞与组织培养的基本技术 4.2.1 体外培养的特点 4.2.2 培养条件和工具 4.2.3 原代培养和传代培养技术 4.2.4 贴壁培养技术 4.2.5 动物细胞培养的传统方法 4.2.6 动物细胞大规模培养技术 4.2.7 动物细胞生物反应器大规模培养 4.2.8 动物细胞培养的现状与展望 4.2.1 体外培养的特点体外培养的特点 1、动物细胞营养需求苛刻：氨基酸（细胞是不能自 主合成必须氨基酸的）、单糖（能源；合成某些氨基
15、酸、脂肪、核酸的原料）、维生素（辅酶、辅基）、其他大量和微量元素、促生长因子和激素（促进细胞 生长、维持细胞功能、保持细胞分化和未分化状态）2、培养环境条件要求严格：温度、渗透压（多数 哺乳动物细胞260320mOsmkg）、pH（及溶氧量 CO2和HO-）的相对恒定、剪切力等。3、易污染、防污染：细菌、真菌、病毒；血清和 组织材料。4.2.2 培养条件和工具培养条件和工具 一、培养条件：1.温度：2.pH：3.气体：4.营养：二、培养工具：1.器皿：2.载体：4.2.2 培养条件和工具培养条件和工具 一、培养条件：1、温度：多数哺乳动物37，偏离则影响代谢和 生长。高温对细胞的威胁更大。2、
16、pH：最适7.27.4，低于6、高于7.6影响生长甚 至死亡。3、气体：容器空间中O2和CO2细胞代谢的进行。O2？CO2？CO2培养箱？4、营养：需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生长因子。4.2.2 培养条件培养条件培养基培养基 1.天然培养基（natural medium）：来自动物体液 或组织分离提取的培养基。种类：生物性液体（如血清）、组织浸液（如胚胎 浸液）、凝固剂（如血浆）等。（1）血清：主要为牛（胎牛、新生牛、小牛）、马、鸡、兔、羊、人血清。各有特点。含各种血浆蛋 白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生长因子及无 机物等，在生理平衡下促进或抑制细胞生长。成分复 杂，不同 种类、不同厂家、不同批号作用有有差异。4.2.2 培养条件培养条件天然培养基天然培养基 血清提供细胞生存、生长和增殖必须的激素与生长 因子：胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素（雌二 醇、孕酮、睾酮）、成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板生长因子（PDGF）（2）鼠尾胶原及其他胶原：细胞附着、生长的 基质，利于组织（特别是上皮类）细胞的固定。（3）鸡胚浸出液：含生长