1、现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.1JAN.2023doi:10.13241/ki.pmb.2023.01.007环黄芪醇治疗白癜风的作用及机制*吴惠林1汪炜2张少君3葛睿3俞文娟1金蝉1周芳1邢倩倩1梁艳3（1 西安医学院第二附属医院皮肤科 陕西 西安 710038；2 西安交通大学第二附属医院 皮肤病院 陕西 西安 710014；3 西安交通大学第一附属医院皮肤性病科 陕西 西安 710061）摘要 目的：探索环黄芪醇（Cycloastragenol，CAG）对白癜风的治疗作用及机制。方法：将正常人皮肤黑素细胞 PIG1 分组如
2、下：对照组、H2O2组、10CAG 组、50CAG 组和 100CAG 组，分别使用不同浓度（10、50、100 M）的环黄芪醇和 250 M 的 H2O2与 PIG1细胞共培养。通过 CCK-8 法测定细胞增殖，Annexin V-FITC/PI 法检测细胞凋亡，并测定细胞中的黑色素、SOD、CAT 和 MDA 含量。将 C57BL/6 小鼠随机分为对照组、模型组和 CAG 组。通过每天涂抹 50 mg 40%的莫诺苯宗乳膏建立白癜风小鼠模型，然后使用 50 mg/kg 的环黄芪醇治疗小鼠。通过 HE 染色和 Masson-Fontana 染色检测皮肤组织中的毛囊和黑色素含量。通过 West
3、ernblotting 检测 MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Bax、Bcl-2、p-p38/p38 的蛋白表达。结果：与 H2O2组相比，50CAG 组和 100CAG 组的细胞活力和黑色素含量均升高，凋亡率均降低，Bax 蛋白表达水平均降低，而 Bcl-2 均升高，SOD 和 CAT 水平均升高，而 MDA 水平均降低（P0.05）。10CAG 组、50CAG 组和 100CAG 组的毛囊和黑色素含量均较 H2O2组增多。与 H2O2组相比，50CAG 组和 100CAG组的 MITF、TYR、TRP-1、TRP-2 和 p-p38/p38 蛋白表达水平均升高（P0.05）。与模
4、型组相比，CAG 组的的 MITF、TYR、TRP-1、TRP-2 和 p-p38/p38 蛋白表达水平均升高（P0.05）。结论：环黄芪醇在细胞水平和动物水平上均能促进黑色素合成，对白癜风具有较好的治疗作用，其机制可能与 p38 信号通路的激活有关。关键词：环黄芪醇；白癜风；黑素细胞；黑色素；p38 信号通路中图分类号：R-33；R758.41文献标识码：A文章编号：1673-6273（2023）01-35-06The Effect and Mechanism of Cycloastragenol in the Treatment of Vitiligo*WU Hui-lin1,WANG W
5、ei2,ZHANG Shao-jun3,GE Rui3,YU Wen-juan1,JIN Chan1,ZHOU Fang1,XING Qian-qian1,LIANG Yan3(1 Department of Dermatology,The Second Affiliated Hospital of Xian Medical University,Xian,Shaanxi,710038,China;2 SkinHospital,The Second Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University,Xian,Shaanxi,710014,China
6、;3 Department of Dermatology andVenereology,The First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University,Xian,Shaanxi,710061,China)ABSTRACT Objective:The purpose of this study was to explore the therapeutic effect and mechanism of cycloastragenol(CAG)onvitiligo.Methods:The normal human skin melanocytes
7、 PIG1 were divided into the following groups:control group,H2O2group,10CAGgroup,50CAG group,100CAG group.PIG1 cells were cultured with different concentrations(10,50,100 M)of cycloastragenol and250 M of H2O2,respectively.Cell proliferation was detected by CCK-8 method,apoptosis was detected by Annex
8、in V-FITC/PI method,and the contents of melanin,SOD,CAT and MDA in cells were determined.C57BL/6 mice were randomly divided into control group,Model group and CAG group.The vitiligo mouse model was established by applying 50 mg of 40%monobenzone cream daily,and thenthe mice were treated with 50 mg/k
9、g cycloastragenol.Hair follicles and melanin content in skin tissue were detected by HE staining andMasson-Fontana staining.The protein expressions of MITF,TYR,TRP-1,TRP-2,Bax,Bcl-2,p-p38/p38 were detected by Western blot-ting.Results:Compared with the H2O2group,the 50CAG group and 100CAG groups had
10、 increased cell viability and melanin content,decreased apoptosis rate,decreased Bax protein expression,and increased Bcl-2 protein expression,increased SOD and CAT levels,anddecreased MDA levels(P0.05).The content of hair follicles and melanin in 10CAG group,50CAG group and 100CAG group werehigher
11、than those in H2O2group.Compared with the H2O2group,the protein expression levels of MITF,TYR,TRP-1,TRP-2 andp-p38/p38 in the 50CAG group and 100CAG group were all increased(P0.05).Compared with the model group,the protein expressionlevels of MITF,TYR,TRP-1,TRP-2 and p-p38/p38 in the CAG group were
12、all increased(P98%）购自上海吉至生化科技有限公司；正常人皮肤黑素细胞 PIG1 购自美国 ATCC；黑素细胞生长添加剂、M254 培养基购自美国 Gibco 公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学；H2O2溶液、Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒、苏木精伊红（HE）染色试剂盒、RIPA 裂解液、总 SOD活性检测试剂盒、购自碧云天生物技术研究所；莫诺苯宗、二甲基亚砜（DMSO）购自美国 Sigma 公司；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）检测试剂盒购自南京建成南京建成生物工程研究所；Masson-Fontana 染色试剂盒、SDS-PA
13、GE 购自北京索莱宝科技有限公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜 购 自 美 国 Millipore 公 司；MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Bax、Bcl-2、p-p38、p38 和 GAPDH 一抗及辣根过氧化物酶标记的 IgG 二抗购自英国 Abcam 公司。1.1.2 实验动物30 只 4 周龄雄性 SPF 级 C57BL/6 小鼠（1618 g）由西安交通大学实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK（陕）2020-005。小鼠饲养于 252、相对湿度 5010%、12 h 的光/暗循环的实验室内，自由进食。1.2 实验方法1.2.1 黑素细胞的培养将 PIG1 细胞以 1105个
14、/mL 的密度接种于组织培养瓶中，培养基为添加了 1%黑素细胞生长添加剂的 M254 培养基，细胞在 37、5%CO2、95%湿度环境中培养，每隔 23 d 更换培养基。1.2.2 环黄芪醇的细胞毒性测定通过 CCK-8 法测定环黄芪醇的细胞毒性。环黄芪醇用 0.1%的 DMSO 溶解。将 PIG1 细胞以每孔 104个细胞的密度接种在 96 孔板中，在 37、5%CO2条件下孵育 24 h。加入不同浓度（0、1、10、50、100、200 M）的环黄芪醇溶液，继续培养 24 h。将 CCK-8 试剂（10 L）加入含有 100 L 培养基的 96 孔板中，在 37、5%CO2的条件下再孵育
15、4 h。用酶标仪在 450 nm 处重复测量吸光度。1.2.3 CCK-8 法测定细胞增殖通过 CCK-8 法测定环黄芪醇对 H2O2诱导到细胞增殖的影响。将 PIG1 细胞做如下分组：对照组、H2O2组、10CAG 组、50CAG 组、100CAG 组。将各组 PIG1细胞以每孔 104个细胞的密度接种在 96 孔板中，在 37、5%CO2条件下孵育 24 h。10CAG 组、50CAG 组、100CAG 组细胞分别加入不同浓度（10、50、100 M）的环黄芪醇溶液培养 24 h。Control 组和 H2O2组细胞正常培养。24 h 后 H2O2组、10CAG组、50CAG 组和 100
16、CAG 组加入 250 M 的 H2O2培养 4 h。对照组正常培养。然后将 10 L 的 CCK-8 试剂加入各组 96 孔板中，在 37、5%CO2条件下再孵育 4 h。用酶标仪在 450 nm 处重复测量吸光度。1.2.4 黑色素含量测定将 PIG1 细胞以 1105个细胞/瓶的密度接种于 T-25 培养瓶中。细胞接种 24 h 后用不同浓度（10、50、100 M）的环黄芪醇孵育 24 h，再 250 M 的 H2O2培养4 h，然后用胰蛋白酶分离细胞，以 1000 rpm 离心 5 min，去除上清液。取内细胞团悬浮于 PBS 溶液中，进行细胞计数。然后，细胞悬液在同等条件下再次离心，将细胞放入微量离心管中，在 80下用 100 L 的 NaOH（1 mmol/L）中溶解 1 h，然后以12000 rpm 离心 20 min，分离上清液放入 96 孔板中，在 405 nm处测量吸光度。1.2.5 Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测PIG1 细胞用不同浓度（10、50、100 M）的环黄芪醇孵育 24 h，250 M 的 H2O2培养 4 h 后，用 Annexi