1、机械损伤对人气道上皮细胞生长的影响赖燕婷 曾惠清 张孝斌 【摘要】目的 通过机械划痕模拟机械损伤，探讨机械损伤对人气道上皮细胞生长及细胞因子分泌的影响。方法 通过机械划痕对气道上皮细胞进行损伤造模，将造模后细胞培养液加入正常培养液构建条件培养液；气道上皮细胞分两组，分别用正常细胞培养液及条件培养液进行孵育 天；法检测细胞增殖情况及活性；染色分析细胞形态；免疫细胞化学检测处理后气道上皮细胞中、表达水平。结果 利用损伤细胞培养液进行培养后，对比正常培养细胞，造模组气道上皮细胞数量降低，活性下降（.）；染色显微镜下观察细胞变化情况，造模后细胞形态未变，胞核染色未变，胞质淡染；免疫细胞化学测定两组细胞
2、因子表达水平，结果提示造模组、表达水平升高（.）。结论 机械损伤可抑制气道上皮细胞生长；缺氧及、通路可能参与了气道机械损伤后的修复过程。【关键词】良性气道狭窄；机械损伤；气管插管 ，【】，；，（.）；，（.），【】；良性气道狭窄指因各类良性病变引起的气道狭窄，临床表现为咳嗽、反复呼吸道感染、不同程度的：基金项目：国家自然科学基金面上项目（）；福建省卫生健康 科 技 计 划 中 青 年 骨 干 人 才 培 养 项 目（）；厦 门 市 科 技 局 卫 生 指 导 性 项 目（）作者单位：福建 厦门，厦门大学附属中山医院呼吸与危重症医学科，福建医科大学第三临床医学院通信作者：张孝斌，：呼吸困难甚至窒
3、息。成人良性气道狭窄常见病因为结核、气管插管和气管切开术后气道狭窄。随着重症医学和呼吸支持技术的发展，接受气管插管、气管切开的病人数量上升，其导致气道狭窄的发生率升高。据报道气管插管 周左右、拔管后 个月左右即可发生气管狭窄。相较于恶性气道狭窄，良性气道狭窄患者生存期长、远期并发症多，反复住院，生活质量差，越来越受到人们的关注，已成为研究热点。本研究旨在通过机械划痕模拟气管插临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期管对气道损伤作用，通过测量造模后细胞生长情况，在细胞水平层面探讨机械损伤对气道上皮细胞的作用，探讨气管插管所致气管狭窄可能的发生发展机制。资料与方法一、实验材料人支气管上皮细胞（）、专用完
4、全培养液外购于赛百慷公司。培养基购于 公司；显色试剂盒、（）购于福州迈新；试剂盒购于；抗体购于 公司；抗体购于 公司；抗体购于 公司；苏木精染色剂购于 公司。本研究伦理审批号：论审第（）号。二、细胞培养 在含有 双抗，胰岛素、氢化可的松的 专用完全培养液（无血清体系），、保持饱和湿度培养，细胞密度约 时进行常规传代。三、细胞造模本课题组参照文献报道的方法，建立上皮细胞机械损伤模型。具体步骤如下：细胞融合后进行换液，然后用 的枪头在单层细胞上以间隔纵横划 条宽约.缺口，无血清培养基培养 后弃去，加新鲜的无血清培养基继续培养，将培养后上清液加入 专用完全培养液建立条件培养液。四、细胞处理将 分为
5、组，每组各设置 个亚组进行重复试验，其中 组用 专用完全培养液培养，组用条件培养基培养，培养 天，倒置荧光显微镜观察各组细胞的形态。五、细胞增殖活性及细胞分子检测 法检测细胞增殖情况细胞按照 个 孔，铺板 孔板，待细胞贴壁后分组进行处理。处理 后，丢弃旧的培养基，加入 试剂进行细胞活力检测，内读取 值。具体步骤参照各种试剂说明书进行。免疫细胞化学利用免疫细胞化学检测处理后 中、表达水平。具体步骤如下：）阻断、灭活内源性过氧化物酶；）正常羊血清工作液封闭非特异位点；）相应细胞因子一抗、二抗孵育；）反应染色、苏木素复染、脱水透明，中性树胶封片；）拍照存档。具体步骤参照各种试剂说明书进行；各抗体工作
6、浓度按说明书进行稀释。染色苏木精 伊红染色方法对细胞处理后 进行染色；具体步骤均参照各种试剂说明书进行。六、统计学分析采用 .软件进行统计学分析，两组间比较用 检验，.为差异有统计学意义。结 果一、细胞基础培养人支气管上皮细胞 基础培养生长情况（图）所示，细胞生长状态良好。图 细胞基础培养生长情况（）二、细胞造模 造模前后生长情况，细胞生长状态良好（图）所示。图 细胞造模前后生长情况（）三、细胞处理后生长情况将 分组培养 天后，倒置荧光显微镜观察各组细胞的形态，两组细胞均表现为扁平、核大而圆、形态不规则，细胞间彼此连接紧密，细胞连接处清晰可见，（图）所示。四、细胞计数临床肺科杂志 年 月 第
7、卷第 期将 分组培养后进行细胞计数，各组数量比较（图）所示，造模后，细胞数量显著降低（.）。图 人支气管上皮细胞（）分组培养后细胞生长情况（）图 人支气管上皮细胞（）分组培养后细胞数量对比五、检测将 分组培养后用 检测法分析两组细胞增殖情况，结果（图）所示，造模后，细胞活性显著降低（.）。图 人支气管上皮细胞（）分组培养后 法检测细胞增殖活性（吸光度对比情况）六、免疫细胞化学将 分组培养后免疫细胞化学分析、表达情况，使用 软件分析组化图像，结果（图）所示，原图（图）所示。结果显示，造模后、表达升高（.）。图 人支气管上皮细胞（）分组培养后免疫细胞化学测定细胞因子结果图 细胞分组培养后免疫细胞化
8、学 染色（）专用完全培养液；条件培养液 七、染色将 分组培养后，染色显微镜下观察细胞变化情况，造模后细胞形态未变，胞核染色未变，胞质淡染，结果（如图）所示。讨 论气管插管和气管切开是导致气道良性狭窄的主临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期图 （苏木精 伊红染色）染色（）：专用完全培养液；：条件培养液要病因，此类患者生存期长，生活质量差，医疗资源及经济资源消耗大，越来越受到人们关注，其参与介导气道狭窄的分子机制复杂，且关于这方面的基础研究不足。良性气道狭窄的发生是气道粘膜损伤和异常修复的过程，最终导致气道重塑。当气道粘膜破坏时，炎症细胞浸润、增生、分化，新生血管形成，其中成纤维细胞分泌大量胶原纤维
9、，造成胶原沉积，肉芽组织老化脱水，成纤维细胞变成具有收缩表现的肌成纤维细胞，发生组织挛缩及瘢痕狭窄，在气道狭窄中起重要作用。气道重塑过程中，过度表达，促进成纤维细胞的募集及向肌成纤维细胞分化，细胞外基质过表达、沉淀和细胞外基质降解减少，参与气道狭窄的形成。等对声门下气道狭窄模型犬注射抗，发现其可明显减轻气道狭窄，从动物层面验证了 在气道狭窄中的作用。随访 例气管支气管结核患者，气管镜评估气管狭窄发生情况，分析血液 浓度，发现气道狭窄组 水平较非狭窄组明显升高。国内学者一项关于大鼠气管移植后移植体狭窄的研究发现，对比对照组，气管移植体内 表达量明显增加，且其变化趋势与上皮细胞间质转化动态变化趋势
10、一致，其研究证明 信号通路参与气管移植后移植体狭窄。和 都是调节上皮间质转化（）的重要通路，通路中当 信号激活后可激活胞内蛋白，抑制 等蛋白形成的 降解复合物的降解活性，稳定细胞质中游离状态的 蛋白。进入细胞核后结合 转录因子家族，启动下游靶基因（如、等）的转录，诱导 转换，介导气道重塑发生。在哮喘小鼠中，通过抑制 通路，小鼠上皮下纤维化及胶原累积明显减少，气道重塑程度明显降低。是一种低氧诱导结合蛋白，在低氧环境下，亚基的降解被抑制，和 亚基形成有活性的，转移到细胞核内调节多种基因的转录，包括 的表达增强，参与炎症反应。等人分析了 例气管插管后气道狭窄患者气道增生组织中 表达情况，发现 在气道
11、肉芽组织中持续存在，参与气管插管后气道狭窄的发病过程，认为其可能是启动和促进这一过程的潜在关键调节因子。本研究通过机械划痕模拟插管机械损伤，对气道上皮细胞进行损伤造模，利用造模后培养基对气道上皮细胞进行培养，对比细胞数及凋亡率，探讨机械损伤对气道上皮细胞增生的影响，结果显示造模后气道上皮细胞的生长速度减慢，且活性降低，差异具有统计学意义，说明机械损伤可抑制气道上皮细胞的正常生长。免疫细胞化学进一步分析两组细胞因子变化，发现造模后细胞、升高，差异具有统计学意义，提示机械损伤破坏上皮细胞后可产生无菌性炎症，促发损伤修复机制，同感染性炎症介导气道重塑相似，导致炎症性细胞因子、过表达，说明 及 通路可
12、能是机械损伤后气道修复的作用机制。气管插管对气道粘膜造成机械损伤的同时，由于气管插管套囊长时间压迫，粘膜局部缺血缺氧，导致缺氧因子 过表达，本研究在细胞层面证实了机械损伤下 的升高，证实缺氧参与了机械损伤介导的炎症反应。综上，本研究认为机械损伤可抑制气道上皮细胞的正常生长；缺氧及、通路可能参与了气道机械损伤后的修复过程。在此，我们提出假设，机械损伤可通过、通路及 参与其气道修复过程，抑制气道上皮细胞的正常增殖，诱导气道上皮细胞间质转化，促进上皮重塑，导致气道发生狭窄，这需要进一步行细胞及动物实验进行验证。参考文献，：（），（）：陈延伟，金发光，李王平，等 我国近五年成人良性中心气管狭窄的病因及
13、类型现状 中华结核和呼吸杂志，（下转第 页）临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期现血浆 含量增高时，要注意患者是否存在其它部位的感染，比如中心静脉导管血流感染、泌尿系感染和胆道感染等。本课题筛选患者时，也排除了感染性疾病、免疫性疾病等，目的就是避免患者入选时就存在脓毒症，从而影响试验结果。综上所述，本研究通过分析血浆 含量与 发生的关系，证实连续监测其含量的变化，有利于早期发现，并可用于病情严重性的评估。但本课题没有进一步研究其与其它炎症因子的关系，以及与其它器官损伤的关系，因此存在一定局限性。参考文献，（）：，：中华医学会呼吸病学分会感染学组 中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗
14、指南（年版）中华结核和呼吸杂志，（）：梁添书，邬敏志，谭家余，等 中性粒细胞弹性蛋白酶对呼吸机相关性肺炎诊断及转归的评估价值 中华危重病急救医学，（）：谭家余，麦志伟，杨博，等 肺泡灌洗液中多种生物标志物的联合检测在呼吸机相关性肺炎早期诊断中的应用 国际检验医学杂志，（）：，：，（）：，：，：，（）：高嵩，吴丁烨，高飞，等 多配体聚糖 检测联合肺部超声评估 患者血管外肺水的程度 中华危重病急救医学，（）：马建永，于丽侠，张海旺，等 感染性休克患者治疗前后血清血管附黏蛋白 与血浆多配体蛋白聚糖 变化及其临床意义 中国预防医学杂志，（）：，（）：金艳，刘文明 多配体蛋白多糖 在慢性阻塞性肺疾病大鼠
15、肺上皮间质转化中的作用及机制 中国应用生理学杂志，（）：，收稿日期：（上接第 页）（）：苏柱泉，魏晓群，钟长镐，等 良性气道狭窄 例病因及介入疗效分析 中华结核和呼吸杂志，（）：王洪武，张楠，周云芝，等 例气管切开 气管插管后良性气道狭窄的疗效分析 国际呼吸杂志，（）：陈兴无，徐军，钟南山 损伤对上皮细胞及上皮下成纤维细胞内皮素的影响 中国病理生理杂志，（）：陈兴无，徐军 气道损伤上皮细胞诱导成纤维细胞转分化的病理意义及离子基础 中华结核和呼吸杂志，（）：于鲲遥，王广发 良性中心气道狭窄的形成机制 国际呼吸杂志，（）：，（）：，（）：段鸿涛，刘红刚，闫小龙，等 介导上皮细胞间质转化在气管移植后移植体狭窄中的机制研究 中国胸心血管外科临床杂志，（）：，（）：，（）：收稿日期：临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期