1、第三章第三章 细胞工程的理论基础细胞工程的理论基础 细胞培养细胞培养(cell culture)技术技术 即是选用各种细胞的最佳生存即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于生命科的技术，是广泛应用于生命科学等研究领域的重要技术。学等研究领域的重要技术。动物细胞与组织培养（动物细胞与组织培养（cell and tissue culture）是动物细胞工程的重要技术基础。）是动物细胞工程的重要技术基础。动物的细胞与组织培养是指从活的机体中动物的细胞与组织培养是指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，取出组织或细胞，模拟机体内生理条
2、件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。技术。组织培养的概念组织培养的概念 组织培养这一名词实际上是一个通用名组织培养这一名词实际上是一个通用名词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培养物的不同可概括为三个不同概念：细胞养物的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、组织培养和器官培养。培养、组织培养和器官培养。A：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养分离成单个细胞，做成细胞悬液
3、，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。养。B：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。为组织培养。从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织培养在生长的同时也发生移动，至使组织培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成难以长时间维持
4、其原有结构，结果也就成了细胞培养。了细胞培养。C：器官培养：是指采取某些措施使器官的原：器官培养：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。术。体外培养的种类体外培养的种类 二、二、细胞培养的现实意义细胞培养的现实意义 生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹 症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白 细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。细胞介素等生长因子及单克隆抗体
5、等。科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾 病的治疗等病的治疗等 三、细胞培养的优点三、细胞培养的优点 1.1.研究的对象是活细胞研究的对象是活细胞 在实验过程中，根据要求可始终保在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测，甚至持细胞活力，并可长时间监控、检测，甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。的形态、结构、生命活动等。2.2.研究条件可以
6、人为控制研究条件可以人为控制 可以根据需要，控制包括可以根据需要，控制包括pHpH、温度、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理、化学的条氧气、二氧化碳、张力等物理、化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。同样可以处于严格控制之下。3.研究的样本可以达到比较均一性研究的样本可以达到比较均一性 通过细胞培养一定代数后，所得到通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法型的细
7、胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。使细胞达到纯化。4.4.研究内容便于观察、检测和记录研究内容便于观察、检测和记录 采用各种研究技术、记录方法：采用各种研究技术、记录方法：研究研究:倒置生物显微镜、荧光显微镜、倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原免疫组织化学、原 位杂交、同位素标记位杂交、同位素标记-记录记录:摄影照片、缩时电影、电视摄影照片、缩时电影、电视-5.5.研究的范围比较广泛研究的范围比较广泛 学科多：学科多：细胞学、免疫学、肿瘤学、生细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物
8、学等物化学、遗传学、分子生物学等 对象广：对象广：各种动物：低等动物各种动物：低等动物-高等动物高等动物-人类人类 一种动物：不同年龄一种动物：不同年龄-不同组织不同组织-正常或异常（肿瘤正常或异常（肿瘤-）6.6.研究的费用相对较经济研究的费用相对较经济 可提供大量、同一时期、重复性好的、生可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。物学性状相似的实验对象。四、细胞培养的缺点四、细胞培养的缺点 现人工模拟体内环境的技术已经很高现人工模拟体内环境的技术已经很高,但但,人工所模拟的条件与体内实际情况人工所模拟的条件与体内实际情况 仍不完全相同仍不完全相同.当细胞被置于体外培养后当
9、细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然发生变化久了，必然发生变化.因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能，又具有某些改变的，特定的细胞群体，而不能将之与体内的细胞完全等同。五、细胞培养的工作原则五、细胞培养的工作原则 有标准化的工作方法有标准化的工作方法 培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKSHANKS液及液及 抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都
10、要标明配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。名称、浓度、消毒与否和制备日期等。一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放。消毒品与未消毒品应分别存放。第二节第二节 组织培养的细胞生物学组织培养的细胞生物学 一、体内外细胞的差异和分化一、体内外细胞的差异和分化（一）体内外细胞的差异（一）体内外细胞的差异 培养细胞最多见的表现是：失去原有组培养细胞最多见的表现是：失去原有组织
11、结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现类似“反祖”类似“反祖”现象；表现为细胞趋单一化，现象；表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。群。1.与体内主要不同：与体内主要不同：相对孤立、相对单一相对孤立、相对单一 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节调节 和细胞相互间的影响和细胞相互间的影响 2.主要表现主要表现 失去原有组织结构和细胞形态失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显分化减弱或不显 细胞趋向单一化；细胞趋向单一化；3.提示提示 要正确认识体外培养细胞要
12、正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体。是一种特定条件下生长的细胞群体。（二）培养细胞的（二）培养细胞的 分化分化 1不适应不适应(Deadaption)：表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶如肝细胞产生酪氨酸转移酶(Tyrosine Aminotranserase)特性特性的丧失的丧失.2脱分化或去分化脱分化或去分化(Dedifferentiation)细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。化的能力。二、培养细胞形态分类二、培养
13、细胞形态分类 体外细胞培养物的生长类型 按生长方式按生长方式:2型型 粘附型细胞粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞能生长的细胞。悬浮型细胞悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面不必附着于固相支持物表面，而而在悬浮状态下即可生长的细胞在悬浮状态下即可生长的细胞。绝大多数有机体细胞属粘附型细胞绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长悬浮状态下生长。体外培养细胞的分型 贴附(粘附)型细胞 粘附粘附:是大多数有机体细胞在体内是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在
14、方式生存和生长发育的基本存在方式 含义含义 两方面两方面 结果结果 基于粘附特性，使细胞与细胞之间基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面粘附于一固相表面 才能生存和生长。才能生存和生长。培养时：这些细胞被放到体外环境中以后培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。因而属于粘附型细胞。粘附粘附(锚定或锚着锚定或锚着)依赖型依赖型(性性)细胞：唯有粘附细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞于固相表面才能生存
15、的细胞 类型类型 细胞在体内、外的粘附方式：存在差异细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类型型 分类分类 根据形态大致的不同，主要根据形态大致的不同，主要2类：类：上皮细胞型上皮细胞型 成纤维细胞型成纤维细胞型 其它，不定型其它，不定型 上皮细胞型 名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于名称：仅形态上
16、似体内，实际上不完全等于-来源：来源于外胚层，内胚层细胞来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核扁平，不规则多角形，中有圆形核 生长特点生长特点 易相连成片易相连成片 相 靠相 靠 紧 密 相紧 密 相连连成薄层成薄层-铺石状铺石状 生长时呈膜状移动生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而很少脱离细胞群而单个活动单个活动 体外培养细胞类型（体外培养细胞类型（1）上皮细胞型上皮细胞型 成纤维细胞型 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞如：真正的成纤维细胞 心肌心肌，平滑肌平滑肌，成骨细胞成骨细胞，血管内皮血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出胞质向外伸出23个长短不等的个长短不等的突起突起 中有卵圆形核中有卵圆