1、11期3285收稿日期：2022-05-31基金项目：国家自然科学基金项目（31972794）；广东海洋大学创新强校项目（230419055）通讯作者：王中铎（1980-），https:/orcid.org/0000-0003-0835-4463，博士，教授，主要从事海洋生物资源与保护研究工作，E-mail：；郭昱嵩（1980-），https：/orcid.org/0000-0002-5178-8526，博士，教授，主要从事海洋生物资源与保护研究工作，E-mail：第一作者：陈子钊（1997-），https:/orcid.org/0000-0002-0935-7220，研究方向为海洋生物资源与
2、保护，E-mail：1078076670 红鳍笛鲷视杆蛋白和长波敏感视蛋白的基因克隆及表达规律分析陈子钊1，刘雪媚1，许振民1，梁秋璐1，王中铎1*，郭昱嵩1，2*（1广东海洋大学水产学院/南海水产经济动物增养殖广东普通高校重点实验室，广东湛江524088；2广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室，广东湛江524088）摘要：【目的】克隆红鳍笛鲷（Lutjanus erythropterus）视杆蛋白（RH1）基因和长波敏感视蛋白（LWS）基因，并分析其在早期发育不同阶段和成鱼不同组织的表达规律，为探究笛鲷属鱼类适应从表层浮游逐步转为下层底栖光环境生活的过程提供理论基础。【方法】利用RAC
3、E克隆红鳍笛鲷RH1基因和LWS基因cDNA全长，利用生物信息学软件对2个基因序列及编码的氨基酸序列进行分析，并利用实时荧光定量PCR检测其在红鳍笛鲷6个胚胎发育时期（原肠下包1/2期、胚孔封闭期、视囊期、晶体出现期、心脏跳动期、孵化出膜期）和5个仔鱼发育时期（1、3、10、15和20 d），以及成鱼不同组织（脑脏、心脏、肝脏、肌肉、黑色皮肤、红色皮肤、胃和视网膜）的表达规律。【结果】红鳍笛鲷RH1基因和LWS基因cDNA全长分别为1723 bp和1302 bp，其中RH1基因具有465 bp的3-UTR和196 bp的5-UTR，开放阅读框（ORF）长度为1062 bp，编码353个氨基酸残
4、基；LWS基因具有213 bp的3-UTR和15 bp的5-UTR，ORF长度为1074 bp，编码357个氨基酸残基。系统发育分析结果显示，2个视蛋白基因均先与鲈形目等鱼类聚为一支，再与鳉形目、鲽形目和鲤形目等聚为一支，最后再与陆生脊椎动物聚为一支。实时荧光定量PCR检测结果显示，RH1基因在孵化出膜后15和20 d的相对表达量显著高于其他时期（P0.05，下同），LWS基因在孵化出膜后20 d的相对表达量显著高于其他时期；2个视蛋白基因在成鱼不同组织的表达模式相似，在视网膜上的相对表达量均显著高于其他组织。【结论】红鳍笛鲷RH1和LWS基因的表达具有组织特异性，且在早期发育阶段的表达水平与
5、红鳍笛鲷的生活习性变化相关，表明红鳍笛鲷RH1和LWS 基因表达与其生活光环境的变化密切呼应，在早期发育变态阶段的光线调节，以及适应黑暗环境等方面发挥重要作用。关键词：红鳍笛鲷；RH1基因；LWS基因；基因克隆；表达分析中图分类号：S965.231；S917.4文献标志码：A文章编号：2095-1191（2022）11-3285-12Cloning and expression regulation of rhodopsin and long-wavesensitive opsin in Lutjanus erythropterusCHEN Zi-zhao1，LIU Xue-mei1，XU Z
6、hen-min1，LIANG Qiu-lu1，WANG Zhong-duo1*，GUO Yu-song1，2*（1Fisheries College，Guangdong Ocean University/Key Laboratory ofAquaculture in South China Sea forAquaticEconomicAnimal of Guangdong Higher Education Institutes，Zhanjiang，Guangdong 524088，China；2Guangdong Provincial Key Laboratory ofAquaticAnima
7、l Disease Control and Healthy Culture，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）Abstract：【Objective】In order to provide a theoretical basis for exploring the process of snapper adaptation from sur-face plankton to bottom benthic light environment.Therhodopsin（RH1）gene and long-wave sensitive opsin（LWS）geneof
8、 Lutjanus erythropterus were cloned and their expression law were analyzed in different stages of early development andin different tissues of adult fish.【Method】The full-length cDNA of RH1 gene and LWS gene of L.erythropterus were南方农业学报Journal of Southern Agriculture2022，53（11）：3285-3296ISSN 2095-1
9、191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2022.11.03053卷南 方 农 业 学 报 32860引言【研究意义】视蛋白（Opsin）是一类约含350个氨基酸残基，含有7个跨膜结构域，隶属于G蛋白偶联受体超家族（G protein-coupled receptors，GPCR）的成员（Bowmaker and Hunt，2006）。根据是否参与视觉成像，可将视蛋白分为视觉视蛋白和非视觉视蛋白两大类。视杆蛋白（Rhodopsin，RH1）和长波敏感视蛋白（Long-wave sensitive opsin，LWS）作为直接参与视觉
10、成像的2种重要视觉视蛋白，不仅对外界不断变化的光环境视觉和信号系统适应方面发挥重要作用，而且在物种的进化上也具有重要影响（Cortesi et al.，2015）。相关研究表明，鱼类在不同发育阶段的视蛋白表达种类及生物表达量是适应光谱环境变化的自身调节机制，如黄盖鲽（Pseudo-pleuronectes yokohamae）在生长发育中，RH1基因和LWS基因表达量逐渐上升，SWS1和SWS2b等短波敏感视蛋白基因则逐渐下降（Sato et al.，2021）。此外，鳜鱼（Siniperca chuatsi）、斑马鱼（Danio rerio）等不同鱼类也具有视蛋白基因，且随生长发育其表达量呈
11、动态变化的规律（Takechi，2005；Tang et al.，2022）。红鳍笛鲷（Lutjanus erythropterus）是一种广泛分布于热带和亚热带海域及岩礁地区的暖水性近底层鱼类，是我国南部沿海地区的重要养殖对象，具有很高的经济价值。红鳍笛鲷早期发育过程中历经几次重要的变态发育，从早期的浮游生活到后期的底栖生活，其不同栖息水层的光照环境变化大，视蛋白基因在驱动红鳍笛鲷变态发育过程中起作用。因此，克隆红鳍笛鲷RH1基因和LWS基因，并分析其在早期发育阶段及成鱼不同组织的表达规律，对探究笛鲷属鱼类视觉形成在早期发育及环境适应中的变化机制具有重要意义。【前人研究进展】视觉是动物获取外
12、界信息的重要途径，在觅食、求偶及躲避敌害等方面具有重要作用（Liang et al.，2022）。动物的视觉形成与视网膜上的视觉色素形成有关。Wald（1968）发现了视觉色素的分子结构，组成单位为一个生色基团和一个视蛋白，同时提出视觉色素的光敏感性变化规律和对不同波长的最大吸收峰（max）是由这两者的相互作用而决定。根据序列之间的相似性和max不同，可将视蛋白基因划分为5种亚型，分别为视锥蛋白中的长波敏感视蛋白（Long-wave or middle-wave sensitive opsin，LWS/MWS）、紫外敏感视蛋白和蓝色敏感视蛋白（Short-wave sensitive opsi
13、n/SWS1-like opsin，SWS1/SWS2）、绿色敏感视蛋白（Rhodopsin-like opsin）及视杆蛋白中的RH1（Rhodopsin）（刘楚吾等，2015）。国外学者对 视 蛋 白 的 研 究 早 于 国 内，Nathans 和 Hogness（1983）于1983年在牛眼睛上克隆获得第一个视杆蛋白基因；Kim等（2019）则通过实时荧光定量PCR和石蜡切片探究赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）幼体发育过程中视蛋白基因的表达和定位情况，结果发现MWS、LWS和RH1基因在视网膜中高度表达。此外，Kasagi等（2015）研究了日本比目鱼（Verasper
14、cloned by RACE technology.Thesequence of the two genes and the encoded amino acid sequence were analyzed by bioin-formatics software.Real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）method was used to detect the embryonic develop-ment stages of L.erythropterus（1/2 epiboly stage，blastopore closure sta
15、ge，optic capsule stage，eye lens formed stage，heart-beating stage，hatching stage）and larval developmental stages（1，3，10，15 and 20 d），as well as the expression pat-terns in different tissues of adult fish（brain，heart，liver，muscle，black skin，red skin，stomach and retina）.【Result】Thefull-length cDNA of R
16、H1 gene and LWS gene of L.erythropterus were 1723 bp and 1302 bp，respectively.The RH1 genehad 465 bp 3-UTR and 196 bp 5-UTR with 1062 bp open reading frame（ORF），encoding 353 amino acids；the LWSgene had 213 bp 3-UTR and 15 bp 5-UTR with 1074 bp ORF，encoding 357 amino acids.Phylogenetic analysis showedthat the two opsin genes clustered first with Perciformes，and then clustered with Killiformes，Pleuronectiformes andCypriniformes，and finally with terrestrial vertebrates.qRT-PCR detection results sho