1、环境昆虫学报2022，44(6):1502 1509http:Journal of Environmental Entomologydoi:10.3969/j.issn.1674 0858.2022.06.20肖月，张锦花，陈健鑫，洪永生，张东华，马焕成，伍建榕红火蚁病原真菌分离鉴定及致病性研究 J 环境昆虫学报，2022，44(6):1502 1509红火蚁病原真菌分离鉴定及致病性研究肖月1*，张锦花1*，陈健鑫1，洪永生1，张东华1，马焕成2，伍建榕1，2(1.西南林业大学生物多样性保护学院，云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，昆明 650224;2.西南林业大学林学院，西南地区生物多样
2、性保育国家林业局重点实验室，昆明 650224)摘要:红火蚁 Solenopsis invicta 是世界上最具破坏力和威胁性的入侵检疫害虫之一，对农林业生产安全、公共设施以及人体健康都造成了巨大影响。为筛选对红火蚁有致病性的病原真菌，本研究通过组织分离法对自然罹病的红火蚁进行致病菌分离，结合病原形态学及分子生物学的方法对病原真菌进行鉴定并采用喷雾法测定了病原真菌对红火蚁的致病力。结果表明:从罹病红火蚁上分离出 3 株病原真菌 HHYSFJ01、HHYSFJ02 和 HHYSFJ05，分别为红绶曲霉 Aspergillus nomius、淡紫拟青霉 Purpureocillium lilaci
3、num 和球孢白僵菌 Beauveria bassiana。致病性测定，这 3 株病原菌对红火蚁均具有较强的致病性，且 3 株病原菌致病性间差异显著。经 1.0 108孢子/mL 孢子悬浮液喷雾处理红火蚁 10 d 后，球孢白僵菌菌株 HHYSFJ05 的致病性最强，红火蚁工蚁的校正死亡率为84.71%，LT50为 4.67 d;红绶曲霉菌株 HHYSFJ01 和淡紫拟青霉菌株 HHYSFJ02 次之，红火蚁工蚁的校正死亡率分别为 78.82%和 73.29%，LT50分别为 4.99 d 和 5.20 d。关键词:红火蚁;病原真菌;分离鉴定;致病力中图分类号:Q968.1;S433文献标识码
4、:A文章编号:1674 0858(2022)06 1502 08基金项目:国家自然科学基金项目(31860208);国家重点研发计划(2019YFD100200X，2021YFD1000500);西南林业大学木棉纤维人工林产业化培育省级创新团队项目(2018HC014)*共同第一作者:肖月，女，硕士研究生，研究方向为森林病理学，E mail:1471564958 ;张锦花，女，本科生，E mail:1922957569 共同通讯作者 Author for correspondence:张东华，女，博士，讲师，主要从事资源微生物利用研究，E mail:1391967127 ;伍建榕，女，博士，教
5、授，主要从事森林病理和资源微生物利用研究，E mail:1176279044 收稿日期 eceived:2022 07 11;接受日期 Accepted:2022 09 04Isolation，identification and pathogenicity of entomogenous fungi to redimported fire ant Solenopsis invictaXIAO-Yue1*，ZHANG Jin-Hua1*，CHEN Jian-Xin1，HONG Yong-Sheng1，ZHANG Dong-Hua1，MAHuan-Cheng2，WU Jian-ong1，2(1.
6、Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control inUniversities of Yunnan Province，College of Biodiversity Conservation，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China;2.Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China，StateForestry Administration，College of Biodiversity Forest
7、ry，Southwest Forestry University，Kunming650224，China)Abstract:ed imported fire ant(IFA)was one of the most destructive and threatening intrusioninspection and quarantine pests in the world，which has a huge impact on agricultural and forestryproduction safety，public facilities and human health.In ord
8、er to screen for entomogenous fungi that werepathogenic to IFA，in this study，the tissue separation method was used to isolate the pathogenicbacteria of IFA that naturally diseased，combining pathogen morphology and molecular biology methods6 期肖月等:红火蚁病原真菌分离鉴定及致病性研究to identify entomogenous fungi of IFA
9、 and using the spray method to determine the pathogenicity ofIFA entomogenous fungi.The results showed that three strains of infected IFA parasitic fungiHHYSFJ01，HHYSFJ02 and HHYSFJ05 were isolated，namely Aspergillus nomius，Purpureocilliumlilacinum and Beauveria bassiana.Pathogenicity determination
10、showed that all three strains had strongpathogenicity to IFA，and the difference of pathogenicity among the three strains was significant.Afterspray treatment with 1.0 108conidia/mL suspension for 10 days，the strain HHYSFJ05 was morevirulent to IFA than other isolates.Strains HHYSFJ01 and HHYSFJ02 we
11、re slightly weaker，thecorrected mortality rates of IFA were 80.00%and 74.44%，LT50were 4.99 d and 5.20 dKey words:Solenopsis invicta;pathogenic fungi;isolation and identification;pathogenicity红火蚁 Solenopsis invicta Buren，隶属膜翅目Hymenoptera 蚁科 Formicidae 火蚁属 Solenopsis，原产于南美洲，是一种极具破坏力和威胁性的入侵检验检疫害虫(Allen
12、 and Buren，1974;Pitts et al.，1990)。红火蚁具有食性杂、繁殖能力强，且会叮咬人畜和啃咬公共设备等危害特点。因此，对人体健康、公共安全、农林业生产和生态环境等造成严重危害(刘政军等，2005;潘运方，2013)。2004 年 9 月，广东吴川地区首次发现红火蚁疫情，这也成为了红火蚁入侵我国大陆的标志(曾玲等，2015)。2005 年 1 月，红火蚁被我国正式列为入境检疫性害虫(王福祥等，2005)。目前，红火蚁的防治主要依赖于化学药剂，但化学药剂的大量使用会造成环境污染，且成本较高，同时还会对本地种蚂蚁种群造成破坏(宋侦东等，2009)。昆虫病原真菌具有易培养、环
13、境友好、害虫不易产生抗性等特点，已被越来越多地应用于害虫生物防治实践(刘春来，2017)。据报道，国外利用病原真菌防治红火蚁研究已开展多年，白僵菌属 Beauveria sp.、拟青霉属Paecilomyces sp.、多毛菌属 Hirsutella sp.以及耳霉属 Conidiobolus sp.的一些真菌对红火蚁均有一定的防治效果(Shah and Pell，2003)。在国内，据相关研究表明，球孢白僵菌 B.bassiana、淡紫拟青霉 P.lilacinus(Thom.)Samson 和金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae 对红火蚁工蚁有一定的致病力(杨佳后等，2
14、009;吕利华等，2011;王磊等，2018)。尽管国内外对红火蚁的病原真菌都有相关的研究，但可利用的昆虫病原真菌资源及生防制剂相对来说还较少，利用昆虫病原真菌防治红火蚁在世界范围内仍是难题，作为可开发为环境友好型生防制剂的重要资源，筛选出对红火蚁致病力较高的菌株可为昆虫病原真菌的应用研究奠定基础。本研究通过分离自然感病死亡红火蚁致病菌，采用形态学和分子生物学技术鉴定致病菌并进行致病菌的致病性测定，以期筛选出对红火蚁具有较高致病毒力的病原真菌，为安全高效防控红火蚁提供理论依据。1材料与方法1.1供试虫体的采集及分离在云南省昆明市盘龙区西南林业大学后山树木园、东三环路旁、昆明植物园、石林、嵩明及
15、德宏州芒市等地采集大型红火蚁蚁巢，观察蚁巢的基本特征，并拍照记录。采集红火蚁健康虫体及病死虫体，参照吕利华(2006)等方法在室内饲养。及时对病死红火蚁致病菌进行分离、培养及纯化保存。1.2菌株分离及纯化采用冯玉元(2003)组织分离法进行红火蚁致病菌的分离。先用 75%乙醇溶液清洗红火蚁虫体 5 s，然后用 0.1%升汞溶液对虫体表面消毒 2 3 min，最后用无菌水缓慢冲淋 3 次。表面消毒完成后，用灭菌的镊子将红火蚁虫体按头、胸、腹不同部位分开并接种至 PDA(马铃薯 200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL)培养基平板上，于 25恒温培养箱中培养。组织块表面长出
16、菌丝后及时转移到新的 PDA 培养基中，于 25培养箱中倒置培养，重复纯化 3 次后接种于 PDA 试管斜面，菌落长满斜面后于 4冰箱中保存。1.3柯赫氏法则回接验证试验将菌株在 PDA 平板上活化培养 10 d，待菌落表面产生分生孢子后，用适量 0.05%吐温-80 的无菌水溶液洗下孢子，配制为 1.0 108孢子/mL 孢子悬浮液。在塑料杯口均匀涂抹防虫逃逸粉，将各菌株的孢子悬浮液用喷雾法接种到健康的红火3051环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology44 卷蚁工蚁体表，以 0.05%吐温-80 的无菌水溶液处理的红火蚁工蚁为对照，每杯各菌株接种 30 头健康红火蚁工蚁，每组处理 3 个平行。将处理后的红火蚁放入塑料杯中，用无菌脱脂棉加无菌水保湿，将塑料杯杯盖盖好后，在杯盖上扎数个小孔通气。置于 25恒温培养箱内培养 10 d，每天定时观察记录各菌株对红火蚁工蚁的感染和致死情况。待杯中所有红火蚁体表有大量菌丝生长时，用灭菌的接种环从塑料杯内长出菌丝的红火蚁体表挑取少许菌丝，移接到 PDA 培养基平板上，置于 25恒温培养箱中培养，待长出菌