1、浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2023，35(1):33 40http:/www zjnyxb cn陈乐然，郑建波，贾永义，等 红螯螯虾 CHH2 基因的表达特征及其在卵巢发育中的功能 J 浙江农业学报，2023，35(1):33 40DOI:10.3969/j issn 1004-1524.2023.01.04收稿日期:2022-04-06基金项目:湖州市乡村振兴专项(2019ZD2028);浙江省农业(水产)新品种选育重大科技专项(2021C02069-4)作者简介:陈乐然(1997)，女，河北石家庄人，硕士研究生，主要从事动物遗传育种与繁殖
2、研究。E-mail:1939516736 qq com*通信作者，顾志敏，E-mail:guzhimin2006163 com红螯螯虾 CHH2 基因的表达特征及其在卵巢发育中的功能陈乐然1，2，郑建波2，贾永义2，迟美丽2，李飞2，程顺2，刘士力2，刘一诺2，蒋文枰2，顾志敏1，*(1 上海海洋大学 水产与生命学院，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306;2 浙江省淡水水产研究所 农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室，浙江省淡水水产遗传育种重点实验室，浙江 湖州 313001)摘要:为研究高血糖激素基因(CHH)在红螯螯虾卵巢发育中的作用，基于转录组学数据鉴定到红螯螯虾CH
3、H2 基因序列，并对其基本特性进行生物信息学分析。采用实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测了 CHH2 在红螯螯虾不同组织和卵巢发育阶段的表达情况。结果表明，CHH 蛋白在甲壳类物种中高度保守，同源性高达66.84%。qRT-PCR 结果表明，在红螯螯虾的肝胰腺中几乎检测不到 CHH2 表达，在其他组织均有表达，包括肌肉、鳃、肠、心，且在卵巢中的表达水平最高;另外，CHH2 在卵巢发育各个时期(未发育、发育期、快速发育期、成熟期)均有表达，表达水平先升高后降低，在卵巢发育成熟期表达水平最低。此外，在切除单侧眼柄和雌二醇活体注射的红螯螯虾卵巢中，CHH2 表达水平显著降低。通过注射体外合成
4、 CHH2-dsRNA 对红螯螯虾进行 RNAi 干扰试验，结果显示，卵巢发育重要标记卵黄蛋白原基因(VTG)表达水平显著上升。综上所述，CHH2 可能负调控红螯螯虾卵巢发育，研究结果为进一步开发基于 RNAi 的促性腺成熟技术奠定理论基础。关键词:红螯螯虾;高血糖激素基因 2(CHH2);RNAi;卵巢发育;卵黄蛋白原中图分类号:S917.4文献标志码:A文章编号:1004-1524(2023)01-0033-08Expression profiles of CHH2 gene in redclaw crayfish Cherax quadricarinatus and its role i
5、novarian developmentCHEN Leran1，2，ZHENG Jianbo2，JIA Yongyi2，CHI Meili2，LI Fei2，CHENG Shun2，LIU Shili2，LIU Yinuo2，JIANG Wenping2，GU Zhimin1，*(1 Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，College ofFisheries and Life Science，Shanghai Ocean Universi
6、ty，Shanghai 201306，China;2 Key Laboratory of HealthyFreshwater Aquaculture，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Key Laboratory of Freshwater Aquaculture Geneticand Breeding of Zhejiang Province，Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries，Huzhou 313001，China)Abstract:To study the role of crustace
7、an hyperglycemic hormone gene(CHH)in the ovarian development of Cheraxquadricarinatus，sequence of CHH2 gene was identified based on transcriptomic data，and the basic characteristicswere analyzed by bioinformatic qRT-PCR was used to detect the expression level of CHH2 in different tissues and o-varia
8、n development stages The results showed that CHH proteins were highly conserved among crustacean species，and they had high homologies with 66.84%The tissue distribution at transcriptional level displayed that CHH2 washardly to be detected in hepatopancreas，and was detected at low level in muscle，gil
9、ls，heart and intestine，whilehighly expressed in ovary In addition，CHH2 was expressed in all stages of ovarian development and exhibited anabnormal expression pattern with the lowest expression level at mature stage On the other hand，CHH2 expressionwas significantly reduced in ovarian tissues after E
10、SA treatment and E2 injection Furthermore，VTG was regarded asan important marker for ovarian development，VTG-mRNA appeared to be increased through RNAi-induced gene si-lencing In conclusion，CHH2 might negatively regulate ovarian development，and this study would provide new in-sights for further expl
11、oring the mechanism of crustacean ovarian developmentKey words:Cherax quadricarinatus;crustacean hyperglycemic hormone 2(CHH2);RNAi;expression profile;o-varian developmentX-器官-窦腺复合体(XO-SG)是甲壳类动物最重要的神经内分泌器官，它的主要功能是合成与分泌大量神经肽激素，类似于脊椎动物的下丘脑垂体系统1。其中，甲壳类高血糖激素神经肽家族(CHH/MIH/GIH/MIOH)是 XO-SG 分泌最多的激素，已被证明参与甲
12、壳动物的多种生理活动。研究表明，高血糖激素基因(CHH)可以调节甲壳类动物渗透压、血糖代谢和变态过程2 4。此外，CHH 还与甲壳动物的繁殖和蜕皮有关5。目前已在多个甲壳类动物中鉴定获得高血糖激素肽序列，包括龙虾6、螃蟹7 8、小龙虾9 10、对虾等11 12。在十足目甲壳类动物中，眼柄切除被认为是促进卵巢成熟和产卵最有效的手段，主要是眼柄切除干扰 XO-SG 分泌性腺抑制激素13。尽管切除眼柄能明显促进卵巢发育，但仍存在一些问题:1)术后雌虾死亡率高且只能使用 1 次，卵子成熟质量差、繁育效率低;2)眼柄切除促进卵巢发育的分子机制知之甚少，制约甲壳类动物养殖业的可持续发展14。因此，研究 C
13、HH 在甲壳类动物卵巢发育中的作用有重要意义。红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)俗称澳洲淡水龙虾，隶属于节肢动物门(Arthropoda)甲壳纲(Crustacea)十足目(Decapoda)拟螯虾科(Pa-rastacidae)光壳虾属(Prawns)，是一种具有重要商业价值的淡水经济虾类，原产于澳大利亚北部和新几内亚南部15 16。近年来，红螯螯虾由于其肉质鲜美、适应性强等优点，在我国养殖规模和产量不断扩大。然而，相对于其他经济虾类，红螯螯虾怀卵量少，为 300 700 颗，导致幼苗价格高昂，限制了该产业的快速发展。为此，着力开展与促进红螯螯虾卵巢发育成熟和排卵相关的
14、研究，对建立苗种规模化繁育技术体系有十分重要的意义。高血糖激素作为甲壳动物眼柄神经节中含量最为丰富并且被研究最多的神经肽，探索其在甲壳动物生长繁殖中的作用广受关注17。已从红螯螯虾中分离到 CHH 基因的几种亚型，包括CHH1、CHH2、CHH-B 等。本研究主要报道 CHH2基因的基因组结构及其生物信息学分析结果。此外，通过实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测CHH2 在不同组织和卵巢发育不同时期的表达水平。最后，通过体内注射双链 RNA 观察抑制CHH2 后对红螯螯虾卵巢发育标记基因 VTG 表达水平的影响。研究结果将有助于揭示红螯螯虾卵巢发育调控机制，也可为实现规模化苗种繁育提供理
15、论支撑。1材料与方法1.1实验样本实验用到的红螯螯虾材料均来自浙江省淡水水产研究所八里店实验养殖基地，暂养于 28水箱中，3 d 后分别选相应雌雄虾(10 月龄，平均体重 55 g)进行解剖，取卵巢、精巢、心、肝胰腺、肌肉、鳃和肠。基于实验室原先的切片结果确定卵巢发育时期划分标准，包括 O-未发育(GSI:0.11)、O-发育期(GSI:0.18)、O-快速发育期(GSI:0.32)、O-成熟期(GSI:0.66)。各时期样本采集完之后立即储存于液氮中，用于后续的核酸提取。1.2总 RNA 提取与 cDNA 合成使用 TRIzol 法提取不同发育阶段卵巢与成虾各个组织的总 RNA，通过 1%琼
16、脂糖凝胶电泳和 Nanodrop 2000c 分光光度计检测总 RNA 的质量和浓度，选择无降解、质量好的 RNA，使用 Pri-43浙江农业学报第 35 卷第 1 期meScriptTMRT 试剂盒和 gDNA Eraser(TaKaRa，日本)，每个样品取大约 0.1 g 总 RNA 用于 cDNA第一链合成。1.3生物信息学分析根据 GenBank 数据库已提交的 CHH2 编码区序列(GenBank Accession No MH210971)，结合实验室已组装完成的红螯螯虾全基因组序列，将 CHH2 编码区序列作为搜索序列进行本地Blast，直接进行基因结构分析，预测外显子和内含子组成。使用 ORF Finder 程序(https:/wwwncbi nlm nih gov/orffinder/)预测 CHH2 的开放阅读框(ORF)，推导出分子量和等电点(pI)。使用 Expasy-PortParam(http/web expasy org/trans-late/)推导 CHH2 氨基酸序列，并预测分子量和等电点(pI)。通过 DNAMAN 软件对不同物种的CHH 蛋白序列进