1、第 29 卷第 5 期2023年 3 月Vol.29，No.5Mar.，2023中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae黄芪甲苷对结直肠癌 HCT116细胞增殖、迁移及侵袭的影响侯本超1，何志坚2，刘海云3*，林倩霞3，方永青3，占诗梦3（1.南昌大学 第一附属医院，南昌 330006；2.江西省肿瘤医院，南昌 330029；3.江西中医药大学 中医学院，南昌 330004）摘要 目的：探究黄芪甲苷对结直肠癌 HCT116细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，并探讨其相关分子机制。方法：将结直肠癌 HC
2、T116细胞分为空白组（DMSO）和黄芪甲苷低、中、高质量浓度组（15.7、31.4、62.8 mg L-1）。通过倒置显微镜观察给药后结直肠癌 HCT116细胞形态的改变；细胞增殖与活性检测-8（CCK-8）法检测黄芪甲苷处理后细胞活性的改变；细胞划痕实验和 Transwell实验观察黄芪甲苷处理后结肠癌 HCT116细胞迁移及侵袭能力的变化；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测结直肠癌 HCT16细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂（p21）、细胞周期蛋白 D1（CyclinD1）及 B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关 X 蛋白（Bax）表达水平。结果：与空白组比较，黄芪甲
3、苷低、中、高质量浓度组细胞生长速度慢，密度明显稀疏，细胞形态不一，细胞核逐渐缩小，细胞质逐渐降解，细胞死亡率高，细胞活力呈浓度依赖性下降，细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制（P0.05，P0.01），其抑制率与给药浓度呈正相关；与空白组比较，黄芪甲苷低、中、高质量浓度组促凋亡蛋白 Bax表达量逐渐升高，呈浓度依赖性，细胞周期蛋白 p21、CyclinD1及抑制凋亡蛋白 Bcl-2表达量逐渐降低（P0.05，P0.01），呈浓度依赖性。结论：黄芪甲苷可抑制结直肠癌 HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭能力，促进细胞凋亡，从而抑制结直肠癌的发生发展。关键词 黄芪甲苷；结直肠癌；增殖；迁移；侵袭中图分类号
4、 R22；R242；R2-031；R285.5 文献标识码 A 文章编号 1005-9903（2023）05-0144-06doi 10.13422/ki.syfjx.20221728 网络出版地址 https:/ 2022-06-30 10:59:51Effect of Astragaloside on Proliferation，Migration，and Invasion of Colorectal Cancer HCT116 CellsHOU Benchao1，HE Zhijian2，LIU Haiyun3*，LIN Qianxia3，FANG Yongqing3，ZHAN Shime
5、ng3（1.The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China；2.Jiangxi Cancer Hospital，Nanchang 330029，China；3.School of Chinese Medicine，Jiangxi University of Chinese Medicine，Nanchang 330004，China）Abstract Objective：To investigate effect of astragaloside on the proliferation，mi
6、gration，and invasion of colorectal cancer HCT116 cells and the underlying molecular mechanism.Method：Colorectal cancer HCT116 cells were classified into blank group（DMSO）and low-dose（15.7 mg L-1），medium-dose（31.4 mg L-1），and high-dose（62.8 mg L-1）astragaloside groups.After drug treatment，the morphol
7、ogical changes of HCT116 cells were observed under an inverted microscope.Cell viability was detected by cell counting kit-8（CCK-8）assay，and the migration and invasion of cells were detected based on scratch assay and Transwell assay.The expression of cyclin-dependent kinase inhibitor（p21），CyclinD1，
8、B-cell lymphoma-2 收稿日期 2022-03-15基金项目 江西省教育厅科学技术研究项目（200143，GJJ201210）；江西省大学生创新创业项目（s202010412060，s202010412077）；CSCO-恒瑞肿瘤研究基金项目（Y-HR2017-128）；江西省卫生厅中医药课题项目（2019B085）第一作者 侯本超，硕士，主治医师，从事肿瘤麻醉学的研究工作，E-mail：通信作者 *刘海云，硕士，副教授，从事中药抗肿瘤的研究工作，E-mail：144第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimen
9、tal Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023（Bcl-2），and Bcl-2-associated X protein（Bax）in the cells was examined by Western blot.Result：Compared with the blank group，cells in the three astragaloside groups demonstrated slow growth，low density，inconsistent morphology，nuclear shrinkage，degrada
10、tion of cytoplasm，and high death rate.Moreover，cell viability decreased in a concentration-dependent manner in the astragaloside groups.Cell migration and invasion were inhibited（P0.05，P0.01），and the inhibition rate was in positive correlation with the concentration of the astragaloside .The express
11、ion of pro-apoptotic protein Bax in low-dose，medium-dose and high-dose astragaloside groups increased gradually in a concentration-dependent manner，while the expression of p21，CyclinD1 and anti-apoptotic protein Bcl-2 decreased gradually in a concentration-dependent manner compared with those in the
12、 blank group（P0.05，P50个细胞的克隆数并计算克隆形成率。克隆形成率克隆数/细胞接种数100%。2.4划痕实验检测 HCT116 细胞迁移能力 取对数生长期 HCT116 细胞接种在 6 孔板，待细胞长至90%，用 Tip 1 mL制造同等伤口，并进行分组及给药处理（每孔添加 2%FBS）。培养 48 h，观察和拍照记录伤口大小，用 Image J软件计算细胞相对迁移率。2.5Transwell 法检测 HCT116 细胞侵袭能力 取对数生长期的 HCT116 细胞，接种在 Transwell上室中，待贴壁后进行给药处理，下室添加 20%FBS。培养 48 h，取出小室，结晶
13、紫固定及染色 1 h，最后在显微镜下拍照和分析。2.6 蛋 白 免 疫 印 迹 法（Western blot）检 测 p21、CyclinD1、Bax 和 Bcl-2 蛋白表达水平 取对数生长期 HCT116 细胞，接种在 6 孔板中，待细胞贴壁后，丢弃培养液，各孔加入对应浓度黄芪甲苷溶液，放入培养箱中继续培养 48 h，根据 BCA 试剂盒说明测定样品蛋白浓度。将样品放在 10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到 0.25 m PVDF 膜上，然后用 5%脱脂奶粉封闭，加入一抗 p21、CyclinD1、Bax和 Bcl-2（1 1 000），4 过夜孵育，次日继续孵育二抗（1 2 00
14、0）。曝光处理。使用 Image Lab软件分析图像。统计条带灰度值，计算相应蛋白表达量。2.7统计学分析 采用 SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料用x s表示，采用 t检验进行两两比较。P0.05为差异具有统计学意义。3 结果3.1黄芪甲苷对结直肠癌细胞 HCT116 形态的影响 与空白组比较，黄芪甲苷低质量浓度组细胞生长速度略慢，代谢旺盛，形态和大小正常；黄芪甲苷中质量浓度组细胞生长速度慢，死亡率偏高，细胞体积明显变小；黄芪甲苷高质量浓度组细胞生长速度慢，细胞死亡率高，密度明显稀疏，细胞形态不一，部分细胞胞质已降解。见图 1。3.2黄芪甲苷对结直肠癌细胞 HCT116 活力的影
15、响 与空白组比较，黄芪甲苷低、中、高质量浓度组HCT116 细胞活力在 48、72 h 均受到显著抑制（P0.01）。见表 1。3.3黄芪甲苷对结直肠癌细胞 HCT116 克隆形成能力影响 与空白组比较，黄芪甲苷低、中、高质量浓度组 HCT116 细胞增殖克隆能力受到明显抑制（P0.05，P0.01），且随着浓度增加细胞克隆能力逐渐降低。见表 2、图 2。3.4黄芪甲苷对结直肠癌细胞 HCT116 的迁移能力的影响 与空白组比较，黄芪甲苷低、中、高质量浓度组伤口面积趋于增大，细胞迁移能力减弱，抑制了细胞迁移能力（P0.05，P0.01），呈浓度依赖性，见表 3、图 3。3.5黄芪甲苷对结直肠癌
16、细胞 HCT116 侵袭能力的影响 与空白组比较，黄芪甲苷低、中、高质量浓度组侵袭细胞数目明显减少（P0.05，P0.01），细胞注：A.空 白 组；BD.黄 芪 甲 苷 低、中、高 质 量 浓 度 组（图 2-图 6同）图 1黄芪甲苷对 HCT116细胞形态的影响（倒置显微镜，100）Fig.1 Effect of astragaloside on HCT116 cell morphology（inverted microscope，100）146第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023侵袭能力下降明显。见图 4、表 4。3.6黄芪甲苷对结直肠癌细胞 HCT116 增殖蛋白表达的影响 与空白组比较，黄芪甲苷低、中、高质量浓度组细胞增殖相关蛋白 p21、CyclinD1明显下降（P0.05，P0.01）。见图 5、表 5。3.7黄芪甲苷对结直肠癌细胞 HCT116 凋亡蛋白表达的影响 与空白组比较，黄芪甲苷处理