1、广西农学报Journal of Guangxi Agriculture第 37 卷第 6 期Vol.37，No.6352022 年 12 月December，2022黄颡鱼迟缓爱德华氏菌的分离鉴定与药物敏感实验祝镔（广西岑溪市三堡镇水产畜牧兽医站，广西 岑溪 543215）摘要：【目的】确定导致广西 3 个大型养殖场黄颡鱼大量死亡的原因，筛选出具有较好疗效的药物，为黄颡鱼迟缓爱德华氏菌的预防控制提供有力的技术支持。【方法】从广西多个养殖场采集死亡黄颡鱼内脏组织，按常规方法进行病原分离鉴定及选取临床常用的 34 种药物进行药物敏感试验。【结果】从鱼内脏组织中分离到 3 株病原菌，分别命名为 GX
2、LJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3。通过形态学、生理生化特性、16SrDNA 鉴定，确定为迟缓爱德华氏菌。经药物敏感试验，菌株对恩诺沙星等 16 种药物敏感，对 9 种药物中度敏感，对 9 种药物表现为耐药。【结论】迟缓爱德华氏菌是致黄颡鱼及同池养殖的青鱼、鲢鱼、罗非鱼等鱼类死亡的病原；通过药物敏感试验筛选出恩诺沙星等 16 种敏感药物，在生产过程中可根据实际情况选用对迟缓爱德华氏菌进行预防和治疗。关键词：黄颡鱼；迟缓爱德华氏菌；分离鉴定；药物敏感实验中图分类号：S943 文献标识号：A 文章编号：1003-4374（2022）06-0035-06Isolation and Id
3、entification of Edwardsiella tarda in Pelteobagrus fulvidraco and Analysis of Drug Sensitivity TestZhu Bin（TheStationofAquaticAnimalHusbandryandVeterinaryofSanbaoTown,Cenxi,Guangxi543215,China）Abstract:【Objective】ThecausesofthedeathofPelteobagrus fulvidraco in three large farms in Guangxi were deter
4、mined,and the drugs with good efficacy were screened to provide strong technical support for the prevention and control of Edwardsiella tarda in Pelteobagrus fulvidraco.【Method】Thevisceraltissuesof dead Pelteobagrus fulvidraco were collected from several farms in Guangxi.The pathogens were isolated
5、andidentifiedaccordingtoconventionalmethods,and34drugscommonlyusedinclinicwereselectedfordrugsensitivitytest.【Result】ThreestrainsofpathogenswereisolatedfromfishvisceraltissuesandnamedasGXLJ20-1，GXLJ20-2andGXLJ20-3，respectively.ItwasidentifiedasEdwardsiella tarda bymorphological,physiologicalandbioch
6、emicalcharacteristicsand16SrDNAidentification.Thedrugsensitivitytestshowedthatthestrainwassensitiveto16drugssuchasenrofloxacin,moderatelysensitiveto9drugs,andresistantto9drugs.【Conclusion】Edwardsiella tarda is the pathogen causing death of Pelteobagrus fulvidraco,black carp,silver carp,tilapia and o
7、ther fish cultured in the same pond.Through thedrugsensitivitytest,16sensitivedrugssuchasenrofloxacinwerescreenedout.Intheproductionprocess,Edwardsiella tarda can be treated and prevented according to the actual situation.Key words:Pelteobagrus fulvidraco,Edwardsiella tarda,isolation and identificat
8、ion,drug sensitivity test收稿日期：2022-07-20 修回日期：2022-08-15作者简介：祝镔，男，1977 年生，水产工程师，主要从事动物疫病防控工作。广西农学报362022 年黄颡鱼属于鲶形目鲿科黄颡鱼属，是我国重要的淡水经济鱼类，为广温性鱼，广泛分布于我国除西部高原外的国内各水域，因其皮光无鳞、肉质细嫩、鲜美回甘、肌间刺少、个体小、营养丰富等原因，受到消费者的喜爱。1黄颡鱼富含多种蛋白质和氨基酸，有助于人体锌、硒等微量元素的补充。1，2医林集要中记载，黄颡鱼具有益脾健胃、利尿消肿等功效，还具有抗衰老、促进儿童生长发育等作用。消费者的高度认可推动了黄颡鱼的人
9、工养殖，先后涌现“黄优 1 号”3、“全雄 1 号”4 等国家级新品种，2020 年全国黄颡鱼养殖总产量达56.5 万吨，实现每 667m2产量近 5000kg，在我国特色淡水鱼类养殖产量中排名第一，并逐渐成为我国水产养殖的重要组成部分。5然而随着养殖规模的扩大、养殖密度和集约化程度的提高，病害逐渐凸显，尤其细菌性疾病频繁暴发，给黄颡鱼养殖业造成较大的经济损失。先后出现红头病、裂头病、鱼体溃疡病、腹水病、出血性水肿以及多种寄生虫病。主要病原有迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、小肠结肠炎耶尔森 氏 菌（Yersinia enterocolitica）、鮰 爱 德 华 氏 菌
10、（Edwardsiella ictaluri）、嗜水气假单胞菌（Aeromonas hydrophila）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）6以及车轮虫、指环虫等。7迟缓爱德华氏菌又叫迟钝爱德华氏菌，是肠杆菌科爱德华菌属的革兰氏阴性短杆菌，有鞭毛，无荚膜，不形成芽孢，广泛存在于溪水、湖泊等淡水和海洋等水环境中，能感染多种动物，包括鱼类、两栖类、爬行类、鸟类以及哺乳动物，该菌是爱德华氏菌属中唯一能感染人的致病菌，能引起人的肠胃炎、腹泻等。8学者们先后在斑马 鱼（Danio rerio）9、大 菱 鲆（Scophthalmus maximus）10、日本鳗鲡（Anguilla ja
11、nponica）11、罗非鱼（Oreochromis mossambicus（Peters,1852）12、牙鲆（Paralichthys olivaceus）13、鳜鱼（Siniperca chuatsi）14、黄鳝（Monopterus albus）15等 20 多种鱼类中发现了该菌感染的病例。本研究从广西多个养殖场死亡的黄颡鱼中先后 分 离 到 3 株 致 病 菌，分 别 命 名 为 GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3。通过形态学、生理生化特性、16SrDNA 鉴定分析等方法，确定分离菌株为迟缓爱德华氏菌，进而通过药物敏感试验，成功筛选出具有较好疗效的药物，为黄颡鱼迟缓
12、爱德华氏菌的预防控制提供有力的技术支持。1 材料与方法1.1 发病情况2020 年 68 月间，广西 3 个大型黄颡鱼养殖场先后出现大量黄颡鱼死亡的病例，病程持续 915d，共造成 3000 尾约 170kg 黄颡鱼死亡，涉及水域29.5hm2，其中 2 个养殖场伴随同池养殖鱼类（青鱼、鲢鱼、鳙鱼、斑点叉尾鮰）的零星死亡。3 个养殖场黄颡鱼发病的临床症状稍有不同，分别表现为：1#养殖场病死鱼体表黏液多、头部发红、肛门红肿、体表有少量红斑；2#养殖场病死鱼除未见头部发红外，其他症状与 1#养殖场相似；3#养殖场病死鱼体表多处发红，鳍条边缘溃烂、黏液多。上述养殖场养殖密度为 30004500 尾/
13、667m2。发病时，水质较差，水呈黄绿色或蓝绿色，透明度510cm；水温 2931；pH 为 7.68.8，溶解氧为3.55mg/L，氨氮浓度为 0.10.25mg/L，亚硝酸盐浓度为 0.10.4mg/L。1.2 主要试剂脑心浸液肉汤培养基（BHI）（购自杭州滨和微生物试剂有限公司），营养琼脂培养基（购自北京陆桥技术股份有限公司），5%山羊血琼脂培养基（在营养琼脂培养基基础上添加 5%山羊血，由作者无菌配制），新型微生物微量生化鉴定管和药物敏感纸片（购自杭州滨和微生物试剂有限公司），Premix Taq Mix（RR003Q）、DL2000 购自宝生物工程（大连）有限公司。1.3 方法1.3
14、.1 细菌分离及形态学观察无菌解剖濒死黄颡鱼，分别采集心、肝、肾等脏器病变组织划线接种于 5%山羊血琼脂培养基，37培养 20h 后，挑取形态特征一致的优势菌落，进行细菌纯化、革兰氏染色，于 1000 倍光学显微镜下观察细菌形态；并将纯化的菌株，接种于 BHI培养基，37培养后，采用甘油保存法，分装样品，并冻存于-70冰箱。161.3.2 生理生化鉴定按照常规方法进行糖、醇类等生化试验，即分别选取 3 株纯化培养的细菌划线培养，挑取单菌落接种于微量生化反应管中，37培养 24h 后，根据37祝镔：黄颡鱼迟缓爱德华氏菌的分离鉴定与药物敏感实验第 6 期各生化反应管的实验结果及常见细菌系统鉴定手册
15、17对各菌株进行鉴定。1.3.3 细菌 16SrDNA 扩增及序列分析分别取上述纯培养细菌接种于 BHI 培养基中，37培养20h 后，按参考文献 18 扩增细菌16SrDNA。PCR 反应体系为50L：Premix Taq 预混液为 25L，菌液 5L，上游引物、下游引物各1L，ddH2O18L。引物序列分别为5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。2 扩增条件为：95预变性5min；95变性 30s、56退火30s、72延伸 90s，共 35 个循环；72延伸 10min；4保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，进行胶回收，由生工
16、生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在 NCBI 上分别进行 BLAST 同源性比对，利用MEGA11.0 软件进行多重序列比对分析，采用邻接法（Neighbor-joiningMethod）构建系统发育树。1.3.4 药物敏感实验根据 Kirby-Bauer 琼脂扩散法测定抑菌圈直径，即分别取 100 L 新鲜培养的 3 种菌液，均匀涂布在5%山羊血平板上，无菌挑取各种药物敏感纸片，分别贴在 5%山羊血平板上，37倒置培养 24h，观察并测定各种药物的抑菌圈直径，依据美国临床实验室标准化协会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）判定分离菌株对药物的敏感性。8-112 结果2.1 细菌形态学观察分离菌形态特性如图1 所示。本研究从濒死黄颡鱼内脏中分离到 3 株细菌，分别命名为 GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3。该菌在血平板上出现明显的溶血，菌落呈圆形、灰白色、表面光滑、边缘整齐、中间略隆起。通过革兰氏染色及显微镜观察，显示该菌为革兰氏阴性短杆菌。AB图 1 分离菌形态特性A：5%山羊血平板培养细菌；B：分离