1、黄连解毒汤含药血清对 A 诱导的海马神经元凋亡及GP78/PEK/CHOP 通路的影响龙春频林泉峰欧阳坚梁卉袁晓兵(萍乡卫生职业学院肿瘤研究实验室，江西萍乡337000)摘要 目的探究黄连解毒汤含药血清对-淀粉样蛋白(A)诱导的海马神经元凋亡及葡萄糖调节蛋白(GP)78/蛋白激酶 样内质网激酶(PEK)/CCAAT-增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)通路的影响。方法将海马神经元细胞随机分为对照组、A 组和黄连解毒汤低、中、高剂量组(2.7、5.4、8.1 g/kg)，对照组加入空白血清培养，A 组加入 A25 35(40 mol/L)和空白血清培养，给药组先加入 A25 35再加入含药血清进行
2、培养。噻唑蓝(MTT)法检测海马神经元细胞活性，TUNEL 法检测海马神经元细胞凋亡，Western 印迹检测抗凋亡基因 B 细胞淋巴瘤(Bcl)-2、促凋亡基因 Bcl-2 相关 X 蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3 及 GP78、PEK 和 CHOP 表达水平。结果与对照组相比，A 组细胞活性明显降低，细胞凋亡指数明显升高，Bcl-2/Bax 水平显著降低，cleaved-/pro-Caspase-3 水平显著升高，GP78、PEK 和 CHOP蛋白表达显著升高(均 P0.05);与 A 组比较，黄连解毒汤各组细胞活性明显升高，细胞凋亡指数明显降低，Bc
3、l-2/Bax 水平显著升高，cleaved-/pro-Caspase-3 水平显著降低，GP78、PEK 和 CHOP 蛋白表达显著降低(均 P0.05)。结论黄连解毒汤含药血清可抑制 GP78/PEK/CHOP 通路，降低 A 诱导的海马神经元细胞的凋亡。关键词 黄连解毒汤;-淀粉样蛋白;海马神经元;细胞凋亡;葡萄糖调节蛋白(GP)78/蛋白激酶 样内质网激酶(PEK)/CCAAT-增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)通路中图分类号 285.5 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0619-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.0
4、3.030基金项目:江西省卫生计生委中医药科研课题(No2018B148)第一作者:龙春频(1970-)，男，高级讲师，主要从事微生物与肿瘤研究。阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病，临床表现为认知障碍和记忆丧失等。老年斑是 AD 的主要病理变化之一，其主要分布在海马区及附近，由-淀粉样蛋白(A)沉积形成1。研究显示，A 能对神经细胞发挥毒性作用，诱导细胞凋亡，在对神经细胞的损伤过程中涉及氧化应激和线粒体凋亡2，3。黄连解毒汤成分为黄连、黄柏、黄芩、栀子，为清热解毒的代表方。研究报道，黄连解毒汤能够通过抗氧化应激，降低栀子导致的肝细胞凋亡4。黄连解毒汤还可以提高神经营养因子水平，减轻氧化应
5、激对神经的毒性作用5。研究显示，细胞凋亡除含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)依赖途径外，与内质网应激(ES)也有密切联系6。Gerakis 等7报道，在 AD 患者的脑组织中，A 沉积可引起神经元发生 ES，导致神经元退变。目前对于黄连解毒汤含药血清对 A 诱导的海马神经元凋亡的影响及其中涉及的机制尚不明确。本研究观察黄连解毒汤含药血清对 A 诱导的海马神经元凋亡及葡萄糖调节蛋白(GP)78/蛋白激酶 样内质网激酶(PEK)/CCAAT-增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)通路的影响，初步探讨黄连解毒汤含药血清对神经元的保护作用及机制。1材料与方法1.1主要试剂与仪器小鼠海马神经元
6、细胞 HT22购自青旗(上海)生物技术发展有限公司;A25 35购自 MCE 公司;2 月龄、体重(20010)g SPF 级雄性SD 鼠 20 只购自广东省医学实验动物中心;DMEM培养基购自 Gibco 公司;6 孔板、24 孔板和 96 孔板购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和 0.2%胰蛋白酶溶液购自武汉普诺赛生命科技有限公司;TUNEL 细胞凋亡(绿色荧光)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;蛋白提取试剂盒和蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;B 细胞淋巴瘤(Bcl)-2 抗 体、Bcl-2 相 关 X 蛋 白(Bax)抗 体
7、、Caspase-3 抗体、GP78 抗体、PEK 抗体和 CHOP抗体均购自 Abcam(中国)公司。生物安全柜购自广州涞泊锐科技股份有限公司;CO2恒温细胞培养箱购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;高速低温离心机购自 SIGMA 公司;电泳仪、凝胶成像仪、酶标仪均购自 Bio-ad 公司。1.2A25 35溶液制备将 A25 35溶于去离子水中，用 0.22 m 滤膜进行过滤，37孵育 7 d，20避光保存。实验使用 10 mol/L A25 358作用于海马神经元细胞建立损伤模型。1.3黄连解毒汤含药血清制备黄连解毒汤处方:黄连9 g、黄柏6 g、黄芩6 g、栀子9 g，加蒸馏水煎煮91
8、6龙春频等黄连解毒汤含药血清对 A 诱导的海马神经元凋亡及 GP78/PEK/CHOP 通路的影响第 3 期浓缩至 1 2，待冷却后缓慢加入乙醇搅拌，使含醇量达 50%后静置 2 d，过滤取上清并回收乙醇，药剂使用前加蒸馏水稀释至所需浓度。将 20 只 SD 鼠随机分为空白组和黄连解毒汤低、中、高剂量组，每组5 只，用药剂量按照动物体表面积比率换算等剂量法，黄连解毒汤低、中、高剂量组大鼠分别以 2.7、5.4、8.1 g/kg 灌胃给药，空白组给予蒸馏水灌胃，灌胃 1 次/d、2 ml/次，连续 7 d。最后 1 次给药3 h后，对各组大鼠进行腹主动脉穿刺取血，离心取上清并除菌灭活，储于20环
9、境备用。1.4细胞培养及分组将 HT22 细胞随机分为5 组，每组各设置 10 个平行对照:1、对照组:给予HT22 细胞空白血清培养 24 h;2、A 组:向 HT22 细胞中加入 A25 35(40 mol/L)和空白血清，培养箱中培养 24 h;3 5、黄连解毒汤低、中、高剂量组:向HT22 细胞中加入 A25 35(40 mol/L)1 h 后再加入黄连解毒汤含药血清，培养 24 h。1.5MTT 法检测海马神经元细胞活性将 HT22细胞以 5104个/ml 的密度接种于 96 孔板中培养过夜，按照 1.4 中的分组进行处理。每孔加入 20 lMTT 溶液，继 续 孵 育 4 h 后，
10、1 500 r/min 离 心10 min，弃去培养基，每孔加入 150 l DMSO，避光并用振荡器混匀，通过酶标仪测定每孔细胞的570 nm吸光度(A)值。细胞活性(%)=(A1 5A空白组)/(A1A 空白组)100%，空白组为 150 l的细胞培养基，用以排除培养板和培养基本底吸光值对实验的影响。1.6TUNEL 法检测海马神经元细胞凋亡在24 孔板中放入已消毒的盖玻片，加入密度为 5105个/ml的 HT22 细胞培养过夜，按照 1.4 中的分组进行处理，遵循 TUNEL 检测试剂盒说明书对取出的盖玻片进行固定、洗涤、孵育和显色，荧光显微镜下观察。用不含末端脱氧核苷酸转移酶的标记液代
11、替TUNEL 混合反应液作阴性对照，用阳性对照试剂盒为阳性对照。计算细胞凋亡指数=凋亡(阳性)细胞数/视野细胞总数100%。1.7Western 印迹检测 Bcl-2、Bax、Caspase-3、GP78、PEK 和 CHOP 蛋白蛋白表达水平将 HT22 细胞以 1106个/ml 的密度接种于 6 孔板中培养过夜，按照 1.4 中的分组进行处理。弃去培养基后用胰蛋白酶 消 化 细 胞，终 止 后 低 温 1 500 r/min 离 心10 min，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2 次，再次离心弃上清，加入细胞裂解液，按照试剂盒说明书提取细胞总蛋白。蛋白定量后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺
12、凝胶电泳(SDS-PAGE)，小心取出凝胶并使用电转仪进行聚偏氯乙烯(PVDF)转膜，在室温下用 5%脱脂奶封闭 1 h，加入稀释(1 1 000)的对应一抗，4摇床孵育过夜，弃去一抗溶液并洗涤 PVDF 膜，加入稀释(1 2 000)的二抗溶液，室温摇床 1 h，洗膜 3 次，电化学发光(ECL)显色并用凝胶成像系统拍照。1.8统计学分析采用 SPSS20.0 软件进行单因素方差分析、SNK-q 检验。2结果2.1黄连解毒汤对 A 诱导 HT22 细胞损伤的保护作用对照组 HT22 细胞呈现多极形或锥形，细胞间突起相互连接成网，胞体折光性强。A25 35处理细胞后，细胞突起收缩，胞间连接断裂
13、，胞体折光性下降，可见部分胞体溶解死亡。黄连解毒汤含药血清干预细胞后，可明显改善 A 对 HT22 细胞的形态学损伤，见图 1。2.2黄连解毒汤对 A 损伤 HT22 细胞活性的影响与对照组相比，A 组细胞活性显著降低(P 0.05);与 A 组相比，黄连解毒汤各组的细胞活性显著升高(P0.05)，见表 1。2.3黄连解毒汤对 A 诱导 HT22 细胞凋亡的影响与对照组比较，A 组细胞凋亡指数显著升高(P0.05);与 A 组比较，黄连解毒汤各组的细胞凋亡指数显著降低(P0.05)，见表 1、图 2。图 1黄连解毒汤对 A诱导 HT22 细胞损伤的保护作用(TUNEL 染色，400)026中国
14、老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷表 1黄连解毒汤对 A损伤 HT22 细胞活性、凋亡、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白水平及GP78、PEK 和 CHOP 蛋白表达的影响(xs，n=10)组别细胞活性(%)凋亡指数Bcl-2/Baxcleaved-/pro-Caspase-3GP78PEKCHOP对照组100.000.112.030.021.370.130.400.040.270.060.300.080.240.04A 组48.963.121)74.362.031)0.290.021)1.680.231)1.050.171)0.990.121)0.770.071)黄连解
15、毒汤低剂量组54.783.332)56.421.672)0.450.032)1.220.112)0.830.122)0.730.092)0.650.052)黄连解毒汤中剂量组62.564.342)39.861.192)0.630.032)0.950.082)0.670.102)0.570.072)0.530.052)黄连解毒汤高剂量组72.114.852)21.130.772)0.960.042)0.610.052)0.460.072)0.420.052)0.390.042)F 值317.9264 541.264449.275169.11975.469100.647166.717P 值0.00
16、00.0000.0000.0000.0000.0000.000与对照组比较:1)P0.05;与 A 组比较:2)P0.05图 2黄连解毒汤对 A诱导 HT22 细胞凋亡的影响(TUNEL 染色，100)2.4黄连解毒汤对 A 损伤 HT22 细胞 Bcl-2、Bax和 Caspase-3 蛋白水平的影响与对照组相比，A组细 胞 Bcl-2/Bax 水 平 显 著 降 低，cleaved-/pro-Caspase-3 水平显著升高(均 P0.05);与 A 组比较，黄连解毒汤各组细胞 Bcl-2/Bax 水平显著升高，cleaved-/pro-Caspase-3 水平显著降低(均 P0.05)，见表 1、图 3。2.5黄连解毒汤对 A 损伤 HT22 细胞 GP78、PEK 和 CHOP 蛋白表达的影响与对照组相比，GP78、PEK 和 CHOP 蛋白表达显著升高(均 P0.05);与 A 组比较，黄连解毒汤各组细胞 GP78、PEK 和 CHOP 蛋白表达显著降低(均 P0.05)，见表 1、图 4。1 5:对照组，A 组，黄连解毒汤低剂量组，黄连解毒汤中剂量组，黄连解毒汤高剂量组;图