1、肿瘤防治研究2023年第50卷第1期 Cancer Res Prev Treat,2023,Vol.50,No.163doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2023.22.0483临床研究骨肉瘤中PD-1和CTLA-4的表达与患者临床病理特征及预后的相关性闫广宁，喻玲，赖续文，叶丹丽，王蔚，王卓才Correlation Between PD-1/CTLA-4 Expressions with Clinicopathological Features and Prognosis of Osteosarcoma PatientsYAN Guangning,YU Ling,LAI
2、 Xuwen,YE Danli,WANG Wei,WANG ZhuocaiDepartment of Pathology,General Hospital of Southern Theatre Command,Guangzhou 510010,ChinaCorresponding Author:WANG Zhuocai,E-mail:Abstract:Objective To explore the expression of PD-1 and CTLA-4 in osteosarcoma and their clinical significance.Methods Fifty-eight
3、 cases of osteosarcoma encountered from 2007 to 2016 were enrolled.The expression levels of PD-1 and CTLA-4 were detected through immunohistochemistry(EnVision method).Results PD-1 was positively expressed in 31(53.4%)cases and negatively expressed in 27(46.6%)cases.CTLA-4 was positively expressed i
4、n 19(32.8%)cases and negatively expressed in 39(67.2%)cases.A total of 12(20.7%)cases were PD-1 and CTLA-4 double positive,whereas 20(34.5%)cases were double negative,and 26(44.8%)cases were single positive.The positive expression of PD-1 was correlated with neoadjuvant chemotherapy,tumor metastasis
5、 and relapse,and shortened survival time(P0.05).The positive expression of CTLA-4 was partly related with late Ennecking stage(P=0.051).Double positive expression was related to the highest tumor metastasis and relapse rates and the worst prognosis(P0.05),compared with double negative and single pos
6、itive expression.Conclusion Positive expression of PD-1 and CTLA-4 in osteosarcoma is associated with worse prognosis,whereas double positive expression is associated with the highest tumor relapse and metastasis rates and shortest survival time.These results are potential valuable references for os
7、teosarcoma immunotherapy.Key words:Osteosarcoma;PD-1;CTLA-4;PrognosisFunding:Youth Program of National Natural and Science Foundation of China(No.81802962)Competing interests:The authors declare that they have no competing interests.摘 要：目的 探讨PD-1和CTLA-4在骨肉瘤中的表达及其临床病理意义。方法 收集20072016年南部战区总医院初诊初治骨肉瘤患者
8、58例，运用免疫组织化学EnVision法检测PD-1、CTLA-4蛋白的表达。结果 PD-1阳性31例（53.4%），阴性27例（46.6%）；CTLA-4阳性19例（32.8%），阴性39例（67.2%）；PD-1和CTLA-4双阳性12例（20.7%），双阴性20例（34.5%），单阳性26例（44.8%）。PD-1阳性与是否行新辅助化疗、肿瘤复发和转移有关，PD-1阳性患者无病生存期及总生存期更短（P0.05）；CTLA-4阳性与Ennecking分期较晚有一定关联（P=0.051）；PD-1和CTLA-4双阳性表达较双阴性和单阳性患者术后复发和转移比例显著升高（P0.05），且生存期
9、更短（P0.05）。结论 PD-1和CTLA-4阳性表达的患者预后不良，双阳性患者的预后较差，可作为骨肉瘤免疫治疗的有效依据。关键词：骨肉瘤；PD-1；CTLA-4；预后中图分类号：R738.1 开放科学(资源服务)标识码(OSID)：收稿日期：2022-05-05；修回日期：2022-07-21基金项目：国家自然科学基金青年基金（81802962）作者单位：510010 广州，中国人民解放军南部战区总医院病理科通信作者：王卓才（1967-），男，硕士，主任医师，主要从事消化道及软组织肿瘤病理诊断及研究，E-mail:作者简介：闫广宁（1986-），男，博士，主治医师，主要从事骨肿瘤发生发展的
10、分子及病理机制研究0 引言骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，好发于儿童和青春期，具有局部侵袭和早期肺转移的倾向。新辅助化疗联合手术切除可将5年生存率最高提至70%，但其余患者死于转移和复发1。近年来肿瘤免疫疗法为恶性肿瘤的治疗提供了新的手段，在多种恶性肿瘤中取得了良好疗效，其中CTLA-4和PD-1两种免疫检查点分子是研究热点之肿瘤防治研究2023年第50卷第1期 Cancer Res Prev Treat,2023,Vol.50,No.164一。CTLA-4是一种1型跨膜糖蛋白，主要在活化的T细胞上表达，CTLA-4相对CD28以更高的亲和力竞争性结合B7，降低T细胞增殖能力和细胞因子的分泌
11、2-3。PD-1在T细胞、B细胞、树突状细胞等多种免疫细胞中表达，在T细胞耗竭中起关键作用。PD-1在肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）上的表达可以导致肿瘤免疫耐受4。中和性抗体拮抗以上两种分子可以在多种肿瘤中发挥抗肿瘤作用。本文检测了骨肉瘤中CTLA-4和PD-1的表达，分析其与临床病理特征和预后的关系，为骨肉瘤免疫治疗的靶点选择提供依据。1 资料与方法1.1 病例资料收集本院20072016年初诊初治并明确诊断的58例骨肉瘤患者，临床病理学特征包括性别、年龄、发病部位、切除方式、术前化疗、肿瘤最大直径及Ennecking分期等，见表1。病理诊断经2名以上副高以上职称病理医师复诊确认。1.2 免疫组
12、织化学实验所有含骨标本经脱钙（质软标本除外）、4%中性福尔马林固定后石蜡包埋。免疫组织化学实验经过烤片、脱蜡、3%双氧水封闭、EDTA高压修复后，按照Envision法孵育抗体。一抗为CTLA-4（1:250，兔抗人，购自英国Abcam公司）和PD-1（1:200，小鼠抗人，购自加拿大GenomeMe公司）。二抗、抗体稀释剂及DAB显色剂均购自丹麦DAKO公司。1.3 结果判读CTLA-4和PD-1均定位于细胞膜，出现完整的棕黄色膜染色判定为阳性细胞。随机选取5个高倍镜视野，按阳性细胞占总细胞数的百分比计分：3%为阴性（0分），3%10%为1分，10%25%为2分，25%为3分。阳性细胞着色程
13、度计分：阴性为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分。将上述两项评分相乘作为最终结果：02分为阴性表达，39分为阳性表达。本实验经两位资深病理医师双盲阅片。1.4 随访所有患者术后及化疗结束后皆进行门诊随访、电子病历和电话追踪。总生存期（OS）是指从手术后第一天至死亡或失访时间；无病生存期（DFS）是指从肿瘤切除后到肿瘤复发或转移的时间。1.5 统计学方法所有数据用SPSS25.0软件进行统计分析。当进行生存分析时，采用Kaplan-Meier检验法，使用Log rank检验生存曲线差异。两离散变量分析采用列联表卡方检验或Fisher精确检验。多因素分析采用Cox比例风险模型分析。P
14、232034.5%Location Femur 3356.9%Tibia1017.2%Humerus 813.8%Others 712.1%Neoadjuvant chemotherapy Yes4272.4%No1627.6%Operation Radical resection4984.5%Amputation 915.5%Enneking stage A1424.1%B3967.3%5 8.6%Tumor size(cm)82441.4%83458.6%Histological type Osteoblastic2950.0%Chondroblastic 712.1%Fibroblast
15、ic1627.6%Others 610.3%肿瘤防治研究2023年第50卷第1期 Cancer Res Prev Treat,2023,Vol.50,No.165统计学意义不显著（P=0.051）。CTLA-4与其他临床病理数据间比较无明显差异，见图1、表2。PD-1和CTLA-4双阳性12例（20.7%），双阴性20例（34.5%），单阳性26例（44.8%）。PD-1和CTLA-4双阳性表达患者肿瘤复发率显著高于双阴性及单阳性组（P=0.035）。双阳性表达患者肿瘤转移率显著高于双阴性及单阳性组（P=0.047）。其他临床病理数据间比较差异无统计学意义，见表3。2.2 PD-1与CTLA-
16、4的表达与骨肉瘤患者预后的关系本组中失访12例，死亡27例，术后复发18例，远处转移29例，总生存率约53.4%。生存曲线分析显示PD-1阴性患者的DFS及OS均显著长于阳性患者（P=0.020;P=0.022）。CTLA-4阴性患者的DFS显著长于阳性患者（P=0.014），但两者OS没有明显差异。PD-1和CTLA-4的双阴性组的预后最好，表2 PD-1和CTLA-4表达水平与骨肉瘤患者的临床病理参数的相关性(n(%)Table 2 Correlation of PD-1 or CTLA-4 expression with clinicopathological characteristics of osteosarcoma patients(n(%)Clinicopathological characteristicsPD-1 expressionCTLA-4 expressionPositiveNegativePPositiveNegativePAge(years)0.8640.394 2320(64.5)18(66.7)11(57.9)27(69.2)2311(35.5)9(