1、第 卷第期 年月西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）（）本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版中医药研究黄芪甲苷改善高糖诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍并抑制 通路激活缪晓杰，桂定坤，陈玉强，吕荣，李道鸿，杨绪枫（苏州市第九人民医院老年科，江苏苏州 ；上海交通大学附属第六人民医院肾内科，上海 ）摘要：目的研究黄芪甲苷对高糖诱导足细胞损伤和线粒体功能障碍的保护作用及其分子机制。方法构建高糖（葡萄糖）诱导足细胞损伤模型，分别用低、中、高剂量黄芪甲苷与高糖共处理细胞；检测细胞活性，染色检测细胞凋亡，荧光探针检测线粒体膜电位，试剂盒检测 含量，检测凋亡及足细胞损伤相关蛋白和 通路相关蛋白
2、表达水平。结果与 组相比，组细胞活性降低、细胞凋亡水平增加（），抗 凋 亡 蛋 白（）表 达 降 低，凋 亡 蛋 白（、）表 达 升 高（均）；和 组相比，组改善高糖诱导的细胞活性和细胞凋亡水平（），抗凋亡蛋白（）表达升高，凋亡蛋白（、）表达降低（均）；和 组比较，组细胞线粒体发生功能障碍，单体含量升高，含量降低（均）；和组相比，组改善细胞线粒体功能障碍，聚合物含量升高，含量升高（）。此外，和 组相比，组细胞 通路相关蛋白表达降低（均）；而和组相比，组 通路相关蛋白表达升高（均）。分子对接结果表明 能够与 结合。结论黄芪甲苷能够改善高糖诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍，其机制可能是抑制 通路激
3、活发挥作用。关键词：黄芪甲苷；足细胞损伤；线粒体功能障碍；通路中图分类号：文献标志码：，（，；，）：（），；，（），（），（，）（），（），（），（，）（），（）收稿日期：修回日期：基金项目：年度苏州市中西医结合科研基金项目（）（）通信作者：杨绪枫 ：网络出版时间：网络出版地址：西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）第 卷本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版 ，（），（），（），：；据统计，我国糖尿病患病率为，且呈快速增长趋势，已成为严重的公共卫生问题。其中 的糖尿病患者最终进展为糖尿病肾病（，），糖尿病肾病是糖尿病全身性微血管病变表现之一，也是最严重、危害最大的慢性并发症之一。
4、研究发现，足细胞损伤在 发生发展过程中起重要作用。足细胞是终末分化的肾小球上皮细胞，它附着在肾小球基底膜外侧，是肾小球滤过膜的重要组成部分。时受损的足细胞对 的生成调节紊乱，造成型胶原等基膜样基质增加，导致肾小球硬化，加速 的进展。因此，改善高糖环境下足细胞凋亡对防治糖尿病肾病具有重要意义。黄芪甲苷（，）是黄芪主要活性成分之一，也是 中国药典 年版用以控制其药材质量的指标成分。我们的前期研究显示，可显著改善糖尿病肾病大鼠肾组织病理损伤，减轻 尿 白 蛋 白。此 外，能 够 通 过 通路保护嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞损伤；黄芪甲苷能够保护体外高糖刺激足细胞免受氧化应激的影响。但是，关于黄芪甲苷
5、保护高糖诱导足细胞损伤的具体机制尚未明确。本研究进一步讨论 是否对高糖诱导的足细胞损伤及线粒体功能障碍具有保护作用，并探讨其潜在的作用机制。材料和方法主要试剂和材料小鼠肾足细胞（）购自舜冉（上海）生物科技有限公司，培养基、胎牛血清（）购自 （中国），黄芪甲苷购自成都普瑞法科技有限公司（中国），试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、检测试剂盒以及 染色液购自碧云天生物技术有限公司（上海），线粒体膜电位荧光探针购自上海翊圣生物科技有限公司（中国），兔单克隆抗体、兔单克隆抗体、兔多克隆抗体、兔单克隆抗体、兔单克隆抗体、兔单克隆抗体、兔单克隆抗体、兔单克隆抗体、兔多克隆抗体、兔多克隆抗体、兔多克隆抗体及辣根过氧
6、化物酶（）标记的羊抗兔免疫球蛋白 二抗均购自 （美国）。（）实验根据 试剂盒制造商提供的说明书检测细胞活性。简而言之，将细胞以 孔分组接种在不同处理条件下的 孔板当中，培养 后。每孔加入 试剂，避光孵育，酶标仪检测 波长处的光密度值。细胞分组培养与处理细胞在含 的 培养基，条件下培养。将处于对数生长期的 细 胞 分 为 对 照 组（组，含 葡萄糖的培养基孵育细胞）、等渗对照组（组，含 葡萄糖 甘露醇的培养基共孵育细胞）、高糖诱导组（组，含 葡萄糖培养基孵育细胞）、低剂量 与高糖共处理组（含 葡萄糖 的培养基共孵育细胞）、中剂量 与 高 糖 共 处 理 组（含 葡 萄 糖 的培养基共孵育细胞）、
7、高剂量 与高糖共处理组（含 葡萄糖 的培养基共孵育细胞），筛选出最佳的黄芪甲苷作用浓度用于后续实验。染色将各组细胞收集并用 洗涤次后，多聚甲醛室温固定细胞 。洗涤次去除多余固定液，用含 的 ，室温孵育 。洗涤次后，加入 检测液，避光孵育 。洗涤次后，加入少量 染色液（覆盖住细胞即可），室温放置 ，用 洗涤次，每次 。最后用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下重点观察代表细胞凋亡的绿色荧光信号。检测相关蛋白的表达水平将各组细胞收集并用预冷的细胞裂解液冰浴裂解 ，提取总蛋白。蛋白定量试剂盒进行定量分析，加入 ，孵育期缪晓杰，桂定坤，陈玉强，等 黄芪甲苷改善高糖诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍并抑制
8、 通路激活本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版 ，获取变性的细胞总蛋白。每孔加入 蛋白在 条件下 凝胶电泳分离总蛋白。将分离的蛋白在 条件下转膜，将蛋白转到 膜上。随后用 脱脂奶粉室温封闭，加入按比例稀释后的一抗 孵育过夜，用 充分洗涤 膜次后，加入按比例稀释后 标记的二抗室温孵育，在黑暗环境下加入 反应液进行发光反应，利用凝胶成像仪拍摄蛋白质印迹，最后采用 （）软件分析蛋白的相对表达水平。荧光探针检测线粒体膜电位收集各处理组细胞，加入足够覆盖所有细胞的预先配置好的 工作液，条件下孵育 。弃去细胞培养液，并用 洗涤细胞次后，加入 细胞培养液并置于荧光显微镜下使用 激发波长，发射波长检测
9、 单体绿色荧光信号以及使用 激发波长、发射波长观察 聚合物红色荧光信号。试剂盒检测 含量收集各处理组细胞，按照孔板每孔加入 裂解液的比例加入裂解液，裂解细胞，取上清，用于后续的测定。将 预先配置好的 检测工作液加到检测管内，室温放置 后，加入 样品，迅速用微量移液器混匀后，用化学发光仪测定相对发光单位 值。根据预先测定好的标准曲线计算样品中 的浓度。统计学方法所有实验均进行次平行实验，并用 进行统计学分析，两组间比较采用独立样本检验，多组间比较采用单因素方差分析，并采用 进行事后检验。表示差异具有统计学意义。结果 提高高糖下调的 细胞活力如图所示，我们首先检测 对 细胞的细胞毒性，实验结果发现
10、，分别用、的 处理后，对细胞活性没有明显影响（）。和 组相比，组细胞活性降低（），而用 处 理 后，提 升 高 糖 诱 导 的 细 胞 活 性（），并 随 药 物 浓 度 梯 度 依 赖 性 增 加。由 于 处 理 的 效 果 最 为 明 显，故 而 选 择 处理进行下一步研究。：检测 对 细胞的细胞毒性；：实验检测 对高糖诱导 细胞活力的影响。两组比较，。图 提高高糖诱导的 细胞活力 抑制高糖诱导的 细胞凋亡 染色检测细胞凋亡水平，结果如图 所示，和 组相比，组细胞凋亡水平增加（）；和 组相比，组细胞凋亡水平降低（）。如图 所示，和 组相比，组细胞抗凋亡蛋白（）表达降低（），凋亡蛋白（、，）
11、表达升高（均 ）；和 组相比，组细胞抗凋亡蛋白（）表达升高（），凋 亡 蛋 白（、，）表达降低（均 ）。、等足细胞相关蛋白在足细胞裂孔膜丢失。如图 所示，和 组相 比，组 细 胞 、表 达 降 低（均 ）；和 组相比，组细胞 、表达升高（均）。西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）第 卷本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版：染色检测细胞凋亡；，：检测凋亡相关蛋白和足细胞相关蛋白表达。两组比较，。图 抑制高糖诱导的 细胞凋亡 改善高糖诱导的 细胞线粒体功能障碍结果如图 所示，和 组相比，组细胞线粒体 聚合物含量下降，单体含量升高（均 ）；和 组相比，组细胞线粒体 聚合物含量升高，单
12、体含量降低（均 ）。检测试剂盒结果显示，和 组相比，组细胞 含量下降（）；和 组相比，组 含量升高（）。抑制 信号通路激活结果如图所示，和 组相比，组细胞 信号通路相关蛋白（、）表达升高（均 ）；和 组相比，组细胞 信号通路相关蛋白（、）表达降低（均 ）。期缪晓杰，桂定坤，陈玉强，等 黄芪甲苷改善高糖诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍并抑制 通路激活本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版：荧光探针检测 细胞线粒体功能；：试剂盒检测 含量。两组比较，。图 改善高糖诱导的 细胞线粒体功能障碍 两组比较，。图 抑制 信号通路激活 分子对接显示 靶向作用于 蛋白结果如表所示，与 蛋白之间存在结合位
13、点，发现 和 结合效率最高。因此，选择 进行分子对接，结果如图所示，能够作用在 蛋白 、等氨基酸残基上。讨论糖尿病肾病属中医学“消渴、虚劳、水肿”等疾病范畴。黄芪为豆科植物，是中医常用的“益气药”，具有补气升阳、益气固表、利水消肿、托疮生肌的功效，至今已有两千多年的药用历史，被广泛用于糖尿病及肾脏疾病的治疗。黄芪甲苷是黄芪主要活性成分之一，本研究探讨黄芪甲苷对足细胞活性和凋亡的影响，并进一步探究其潜在的作用机制。西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）第 卷本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版图分子对接显示 与 蛋白的结合位点 表分子对接显示 与 蛋白之间存在结合关系 （）本研究发
14、现，高糖诱导足细胞后，细胞活性降低，凋亡水平升高，抗凋亡蛋白（）表达降低，凋亡蛋白（、）表达升高；而通过黄芪甲甘处理后能够改善高糖诱导的足细胞活性降低和凋亡。当足细胞受到损伤时，和 等足细胞相关蛋白在足细胞裂孔膜丢失，使肾小球滤过电荷屏障减弱，促进蛋白尿的发生；同时，足细胞内的 、等凋亡通路可被激活，诱导足细胞凋亡，。本研究发现，高糖诱导足细胞 和 蛋白丢失，足细胞损伤加重，而黄芪甲苷处理则能改善高糖诱导的足细胞 和 蛋白丢失。尽管糖尿病肾病的发病机制很复杂，但越来越多的证据表明，线粒体功能障碍在糖尿病及其并发症的发生发展中起着重要作用。人糖尿病肾小管和肾小球中线粒体蛋白表达较少，其中足细胞对
15、线粒体功能障 碍 很 敏 感。有 研 究 发 现，在 链 脲 佐 菌 素（）诱导的 动物模型和高脂肪饮食诱导的肾小球病变的动物模型中，足细胞线粒体均出现异常，表明足细胞线粒体功能障碍在 发病机制中的重要性 。还有研究发现，调节线粒体稳态，改善线粒体功能障碍，能够预防糖尿病肾病中的足细胞损伤 。本研究通过 荧光探针检测线粒体膜电位。在正常线粒体内，聚集在线粒体基质中形成聚合物，发出强烈的红色荧光；而在不健康的线粒体中，由于膜电位的下降或丧失，只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光。结果发现，高糖诱导足细胞绿色荧光增强，含量降低，而黄芪甲苷处理则增加红色荧光信号，含量升高，表示黄芪甲苷能够改善
16、高糖诱导的线粒体功能障碍。许多研究表明，信号通路的异常表达与糖尿病肾病及足细胞的具有密切关系。通路在糖尿病肾病肾活检标本中以及 型糖尿病肾病模型中发现 通路被激活 ，而激活 通路促进糖尿病蛋白尿的发生 。靶向 能够通过抑制链霉菌素诱导的糖尿病小鼠中 信号通路激活来减轻肾脏纤维化；通过靶向 信号通路降低高糖诱导的足细胞凋亡。本研究发现，黄芪甲苷能够抑制高糖诱导足细胞的 信号通路激活，并进一步通过分子对接实验发现黄芪甲苷和 具有结期缪晓杰，桂定坤，陈玉强，等 黄芪甲苷改善高糖诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍并抑制 通路激活本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版合位点，暗示黄芪甲苷通过直接与 配体结合，从而抑制 信号。总而言之，本研究发现黄芪甲苷能够改善高糖诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍，并且其可能通过抑制 信号发挥上述作用。为防治糖尿病肾病提供新的治疗思路奠定理论基础。参考文献：中国糖尿病防控专家共识中华预防医学杂志，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：？，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，