1、研究论文2023年第42卷第1期食品与生物技术学报于晓婷，等：海藻酸钙/硅胶/羧甲基壳聚糖复合微球固定化柚苷酶的研究Study on Immobilization of Naringinase on Calcium Alginate/Silica Gel/Carboxymethyl Chitosan Composite MicrospheresYU Xiaoting，CHEN Xiaoyi，LI Miao，WANG Shujing，WANG Tianyu，LI Qian*，LI Xianzhen(School of Biological Engineering,Dalian Polytechn
2、ic University,Dalian 116034,China)Abstract：Naringinase can hydrolyze bitter substances,such as naringin in citrus fruits,which isapplied in juice debittering or preparation of pharmaceutical intermediates,for example,prunin.Inthis study,calcium alginate/carboxymethyl chitosan/silica gel composite mi
3、crospheres,which wereenvironmental friendly and accessible with abundant resources,were prepared by dropping methodand used as carriers for naringinase immobilization.The optimized specific enzyme activity,enzymeloading rate and enzyme activity recovery of immobilized naringinase could reach 203.33
4、U/g,36.80%and 62.15%,respectively,under the following conditions:silica gel/carboxymethyl chitosanmass ratio of 1.01.5,crosslinking time of 2.0 h,immobilization temperature of 25,coupling timeof 4 h,and enzyme dosage of 465.6 U/mL.Meanwhile,compared with the free naringinase,thisimmobilized naringin
5、ase exhibited better stability to pH and thermal changes,and showed thefeasibility of operation and storage.Besides,the application of naringinase immobilized on calcium摘要：柚苷酶可对柑橘类水果中的柚皮苷等苦味物质进行水解，从而实现果汁的脱苦或普鲁宁等医药中间体的制备。作者采用滴入法制备具有环境友好且易获得特性的海藻酸钙/硅胶/羧甲基壳聚糖复合微球，以此作为载体，用于柚苷酶的固定化研究。结果表明，在硅胶/羧甲基壳聚糖质量比1.
6、01.5、交联时间2.0 h、固定化温度25、偶联时间4 h、给酶量465.6 U/mL的实验条件下，复合微球固定化柚苷酶的比活力、载酶率和酶活力回收率分别可达203.33 U/g、36.80%和62.15%。同时，相比游离柚苷酶，该复合微球固定化柚苷酶对pH和温度变化均显示出更好的稳定性，且更易操作和储藏。此外，海藻酸钙/硅胶/羧甲基壳聚糖复合微球固定化柚苷酶的应用能够进一步拓宽柚苷酶在食品、医药等领域的深入发展。关键词：固定化柚苷酶；复合微球；柚皮苷；果汁脱苦；酶学性质；酶促反应动力学中图分类号：Q 814.2文章编号：1673-1689（2023）01-0093-09DOI：10.396
7、9/j.issn.1673-1689.2023.01.008海藻酸钙/硅胶/羧甲基壳聚糖复合微球固定化柚苷酶的研究于晓婷，陈晓艺，李 苗，王淑婧，王添誉，李 佥*，李宪臻（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连116034）收稿日期：2022-03-15基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（31601411，22108024）；辽宁省教育厅科学研究项目（J2020043）。*通信作者：李 佥（1982），女，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事食品酶的制备、固定化及相关应用研究。E-mail：研究论文93RESEARCH ARTICLEYU Xiaoting，et al：Study on
8、Immobilization of Naringinase on CalciumAlginate/Silica Gel/Carboxymethyl Chitosan CompositeMicrospheresJOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 Issue 1 2023alginate/silica gel/carboxymethyl chitosan composite microspheres would further expand thedevelopment of naringinase in food,medicine a
9、nd other fields.Keywords:immobilizednaringinase,compositemicrospheres,naringin,juicedebittering,characteristics of naringinase,kinetics of enzyme-catalyzed reaction酶是一种生物催化剂，因其拥有绿色、环保和可持续发展的优势而受到广泛关注。但是，由于其物理和化学特性的不稳定，使得在实际使用中不能长时间维持其催化活性，因而不能充分发挥其催化作用1。酶固定化技术是通过采用合适的固定化工艺，将游离酶固定到易于循环利用的载体上，固定化材料、制备
10、方法、酶用量以及固定化条件等皆会影响酶的固定化效果2。从1910年开始，随着新型固定化载体的不断涌现，固定化酶领域发展迅速。载体通常需要根据固定化酶的应用要求进行选择3。固定化酶常用的载体可以分为以下4类：无机载体（二氧化硅、活性炭等4）、天然有机物（纤维素、壳聚糖、海藻酸钠等5-6）、合成高分子材料（环氧树脂、聚丙烯腈膜等7）和复合载体（有机物质与无机物质混合构成的载体，例如磁性复合微球等8）。常用的固定化酶方法有以下几种：1）吸附法是指通过范德华力作用，酶和载体进行结合，但是这样的力常常不是很强，造成酶和载体之间反应不够牢固，在使用时，酶很容易脱落进入反应溶液中，造成回收困难9。2）交联法
11、是通过两种或多种功能的交联剂，将酶分子和载体连接起来的固定化方式。为了避免酶从载体上掉落，通常不单独使用交联法，而与包埋法或吸附法组合应用10。3）共价偶联法（又称为共价结合法）是通过在酶和载体之间形成共价键来固定酶的一种工艺。和其他方法相比，该方法反应条件较复杂，不仅在一定程度上会引起酶蛋白在空间上特定结构的变化，还有可能破坏酶的活性中心，从而导致酶活力降低。柚皮苷是一种二氢类黄酮化合物，口感苦涩，在柑橘类果品中十分常见。为了改善其苦涩味道，柚苷酶通常用于去除柚柑类产品（如果汁等）的苦味11。柚苷酶是一种复合酶，具有-L-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40）和-D-葡萄糖苷酶（EC 3.2.
12、1.21）两种活性12-14，其在自然界中的动物、植物、微生物中普遍存在13。柚苷酶水解柚皮苷主要经过两个步骤：第一步，柚皮苷经过-L-鼠李糖苷酶水解为-L-鼠李糖和普鲁宁两种物质，普鲁宁的苦味远低于柚皮苷（其苦味值仅为柚皮苷的一半）；第二步，普鲁宁被-D-葡萄糖苷酶水解生成葡萄糖及柚皮素，这两种产物均没有苦味14。迄今为止，柚苷酶在柑橘类水果脱苦、葡萄酒调味、医药工业等方面发挥着重要作用15-18。在已有固定化柚苷酶的报道中，壳聚糖是一种较为常用的固定化载体，是广泛存在于自然界的天然高分子物质，具有生物相容性好19、安全无毒、易降解等优点20。段志涛等分别用壳聚糖和海藻酸钠微球对柚苷酶进行共
13、价键合，其酶比活力分别为14.34 U/g和12.18 U/g21。此外，作为壳聚糖的衍生物，羧甲基壳聚糖是将羧甲基等基团加入到壳聚糖的内部，其中富含大量的羧基和氨基等功能基团，在中性和碱性条件下，水溶性较好，因此有效改善了壳聚糖的溶解性能22。并且与单纯的壳聚糖材料相比较，羧甲基壳聚糖表现出更优异的生物相容性，同时能够与Ca2+交联产生致密结构，对活性化合物的吸附和控制释放有非常好的效果。肖安风等用聚乙烯醇和海藻酸钠形成的复合材料进行固定化柚苷酶的相关研究，酶比活力达到19 U/g23。与此同时，海藻酸钠也是一种天然多糖类物质，同样可以与Ca2+交联形成网络结24。虽然海藻酸盐微球羟基和羧基
14、含量丰富，但由于其强度不高，导致微球结构相对不稳定，最好引入一些无机载体来增强其机械强度，例如二氧化硅，是最受欢迎的无机载体之一，具有良好的物理和机械稳定性，无膨胀，耐有机物、高酸度和高温等显著优点25。与此同时，海藻酸钠、硅胶、羧甲基壳聚糖均为绿色、对环境友好、价格相对便宜的原料，能够有效降低工业化生产成本。迄今为止，鲜有关于羧甲基壳聚糖和海藻酸钠引入硅胶为材料对柚苷酶进行固定化的报道，作者以羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、硅胶为基材制备微球，对柚苷酶进行固定化，优化了硅胶/羧甲基壳聚糖质量比、交联时间、固定化温度、偶联时间等条件，并探索和分析了固定化柚苷酶和游离柚苷酶发生酶94研究论文2023年第
15、42卷第1期食品与生物技术学报于晓婷，等：海藻酸钙/硅胶/羧甲基壳聚糖复合微球固定化柚苷酶的研究解反应的最适反应pH、最适反应温度、重复使用性等，为创新酶固定化载体，不断拓宽柚苷酶在食品、医药等领域的应用和发展提供了技术准备和数据支持。1.1材料与试剂柚苷酶：黑曲霉FFCC uv-11菌株为作者所在实验室自主保存菌株，经该菌株发酵得到柚苷酶发酵液；柚皮苷（质量分数98%）：中国宝鸡方盛生物开发有限公司产品；硅胶：苏州纳微科技股份有限公司产品；海藻酸钠、羧甲基壳聚糖：上海麦克林生化科技有限公司产品；氯化钙、磷酸氢二钠、戊二醛：天津市大茂化学试剂厂产品；一缩二乙二醇：天津市科密欧化学试剂有限公司产
16、品；氢氧化钠、柠檬酸：天津市东丽区天大化学试剂厂产品。1.2仪器与设备DENVER INSTRUMENT TP-213精密天平：美国丹佛仪器有限公司产品；78-1型磁力加热搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司产品；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：河南省予华仪器有限公司产品；知楚三层立式摇床：上海知楚仪器有限公司产品；PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司产品；HH-8型恒温水浴锅：常州菲普实验仪器厂产品；Tecan酶标仪：勒菲生物科技（上海）有限公司产品。1.3方法1.3.1微球载体及固定化柚苷酶的制备1）滴入法制备海藻酸钙/硅胶/羧甲基壳聚糖复合微球首先配制1.5 g/dL海藻酸钠溶液（溶液A），将100 mL去离子水和1.5 g海藻酸钠加入到250 mL的烧杯中，置于磁力加热搅拌器上进行搅拌至溶解后，再加入1.0 g硅胶和1.5 g羧甲基壳聚糖，继续剧烈搅拌待其形成均一溶液后停止。配制2 g/dL CaCl2溶液（溶液B），称取4 g CaCl2于烧杯中加水溶解，转移到200 mL容量瓶中定容。将溶液B转移至三口烧瓶中，加入磁子后，将其置于恒温加热磁力搅拌器