1、书 书 书犐 犆犛 犆犆犛犅 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准犌犅犜 水生动物犚犖犃病毒核酸检测参考物质质量控制规范假病毒犛 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狇 狌 犪 犾 犻 狋 狔犮 狅 狀 狋 狉 狅 犾狅 犳狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲犿犪 狋 犲 狉 犻 犪 犾 狊犳 狅 狉犚犖犃狏 犻 狉 狌 狊犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犪 狇 狌 犪 狋 犻 犮犪 狀 犻 犿犪 犾 狊犃狉犿狅 狉 犲 犱犚犖犃 发布 实施国 家 市 场 监 督 管 理 总 局国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布书 书 书前言本文件按照 标准化工作导则第部
2、分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会（）归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、连云港海关、北京海关。本文件主要起草人：张、林祥梅、王娜、吴绍强、景宏丽、邓俊花、周毅、谷强、任彤、江育林。犌犅犜 水生动物犚犖犃病毒核酸检测参考物质质量控制规范假病毒范围本文件给出了作为水生动物病毒核酸检测参考物质的假病毒，其质量控制规范的术语和定义、缩略语、原理、试剂或材料、仪器设备，规定了假病毒的质量控制、假病毒的保存、假病毒的验证，以及假病毒质量评价方法
3、。本文件适用于水生动物病毒核酸检测中假病毒（装甲）类参考物质的质量控制。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件。变异系数犮 狅 犲 犳 犳 犻 犮 犻 犲 狀 狋狅 犳狏 犪 狉 犻 犪 狋 犻 狅 狀概率分布离散程度的一个归一化量度，其定义为数据标准差与数据平均值之比。初始样犳 狉 狅 狀 狋狊 犪犿狆 犾 犲按照制备先后顺序，最先制备的批次产品。假病毒犪 狉犿狅 狉 犲
4、 犱犚犖犃外膜蛋白包裹病毒片段形成的病毒样粒子。均匀性狌 狀 犻 犳 狅 狉犿 犻 狋 狔同一生产批次的假病毒，每支含有等量目的基因的状态。溯源性狋 狉 犪 犮 犲 犪 犫 犻 犾 犻 狋 狔假病毒中目的基因序列与病原参考毒株序列的一致性。稳定性狊 狋 犪 犫 犻 犾 犻 狋 狔假病毒在特定保存条件和保存时间范围内，保证检测结果为阳性的能力。犌犅犜 阳性参考物质狆 狅 狊 犻 狋 犻 狏 犲狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲犿犪 狋 犲 狉 犻 犪 犾与病原拥有某些完全相同的特征，如相同的目的基因序列、抗原性、敏感性等，用于该病原检测一定会得出理想的阳性检测结果，通常作为阳性对照判定待测样品是
5、否为病原阳性。中间样犿 犻 犱 犱 犾 犲狊 犪犿狆 犾 犲按照制备先后顺序，中间制备的批次产品。终止样犳 犻 狀 犪 犾狊 犪犿狆 犾 犲按照制备先后顺序，最后制备的批次产品。最小有效取样量犿 犻 狀 犻 犿狌犿犲 犳 犳 犲 犮 狋 犻 狏 犲狊 犪犿狆 犾 犲狏 狅 犾 狌犿犲使用病原检测方法，可检测出阳性结果的最小阳性参考物质的量。缩略语下列缩略语适用于本文件。：氨苄青霉素（）：扩增循环数（）：互补脱氧核糖核酸（）：焦碳酸二乙酯（）：脱氧核糖核酸（）：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（）：三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（）：三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（）：脱氧核糖核苷三磷酸（）：三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（）
6、：溴化乙锭（）：异丙基硫代 半乳糖苷（）：营养肉汤（）：聚合酶链式反应（）：核糖核酸（）：逆转录聚合酶链式反应（）：逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应（）犜犪 狇：水生嗜热菌（犜犺 犲 狉犿狌 狊犪 狇 狌 犪 狋 犻 犮 狌 狊）：溴 氯 吲哚 半乳糖苷（）原理假病毒为一种病毒样粒子，外膜蛋白为 噬菌体蛋白，包裹用于检测病毒的目的片段。假病毒与 噬菌体类似，能够耐受核酸酶的降解，具有较好的稳定性，且不具备自我复制能力和感染能力。犌犅犜 假病毒表达载体含有 噬菌体的成熟蛋白编码基因、衣壳蛋白编码基因和衣壳蛋白编码基因下游影响噬菌体包装的 发夹结构（见附录）；在多克隆位点中插入病毒目的片段后形成重
7、组假病毒表达载体；该载体在蛋白表达系统中能够将插入的外源片段转录成，同时合成的 噬菌体蛋白能够选择性包裹，自组装成病毒样粒子，成为假病毒。目前假病毒的制备方法主要为：先利用酶切连接法制备表达载体，再利用原核或真核表达系统组装假病毒粒子，制备流程按照附录进行。作为病毒检测参考物质的假病毒，应具备以下特征：包含有病毒，可利用 、等核酸检测方法特异性检测到病毒；具有良好的核酸酶耐受性，保护病毒目的不被核酸酶降解；不含有病毒。试剂或材料 本文件中所有化学试剂，除特别注明外，全部为分析纯试剂。水：符合 中一级水规定。水：商品化试剂。试剂和 试剂：商品化试剂。病毒目的的扩增引物：可参照相应的国家标准、行业
8、标准合成。：商品化试剂。：商品化试剂。灭活处理的管、试管、管、移液器枪头：商品化耗材。假病毒载体：由商品化载体构建。制备假病毒所需的其他试剂：按照附录配制。仪器设备 超净工作台。冷冻高速离心机。电子天平。高压灭菌锅。仪。电泳仪。荧光定量仪。紫外分光光度计。凝胶成像系统。移液器。假病毒的质量控制 假病毒中病毒目的犚犖犃片段的检测和溯源性 病毒目的犚犖犃片段的犚犜 犘犆犚检测以所制备的假病毒溶液作为待测样品，定性检测样品中是否含有病毒目的片段。）提取假病毒的。）以为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行 扩增。设置以犌犅犜 水为模板的阴性对照，以病毒为模板的阳性对照。）反应产物进行电泳
9、观察。扩增产物的溯源性分析将 的扩增产物回收、测序。测序结果与相应病毒参考毒株的序列进行比对。假病毒中病毒目的犚犖犃片段的质量判定在 阴性对照和阳性对照都成立的情况下，若同时满足以下两点，则说明病毒目的片段包裹入外膜蛋白：）假病毒的 结果为阳性；）扩增产物序列比对结果显示与相应病毒的参考毒株序列同源性不低于。若假病毒 产物为阴性，则表明假病毒未包裹病毒目的片段，或假病毒提纯失败，应重新制备假病毒或提纯假病毒。假病毒中病毒犮犇犖犃杂质的检测 犘犆犚或狇犘犆犚检测分别以未抽提的假病毒溶液和抽提的假病毒为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行或扩增。设置以水为模板的阴性对照，以假病毒重组
10、质粒为模板的阳性对照。结果判定在阴性对照和阳性对照都成立的情况下：）未抽提的假病毒溶液或假病毒，或结果为阳性，则表明溶液或外膜蛋白中有病毒来源的杂质，则假病毒不能作为参考物质使用，应重新消化去除；）未抽提的假病毒溶液和假病毒，或结果为阴性，则说明病毒已全部去除。假病毒中病毒目的犚犖犃片段的定量使用 方法，对假病毒中病毒目的片段进行定量。所使用的 方法应为针对该病毒目的片段设计建立的方法。标准品可以为病毒，或病毒，或含有病毒目的片段的重组质粒，使用紫外分光光度计测定标准品浓度。将标准品 倍梯度稀释至少个梯度，分别以每个梯度的标准品溶液为模板，进行 反应，根据各梯度标准品的 值和浓度制定标准曲线和
11、公式。根据假病毒的 值，利用标准曲线和公式计算出假病毒溶液中病毒目的片段的浓度。也可以先计算假病毒和标准品的 值的差，再根据公式（）计算出假病毒和标准品之间的浓度比。犡（）（）式中：标准品 值和假病毒 值的差；犡 假病毒和标准品之间的浓度比。犌犅犜 假病毒最小有效取样量的确证 取样量的设定和犚犜 犘犆犚、犚犜 狇犘犆犚确证 分别取、和 假病毒。分别提取组假病毒的。以 为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件，进行 或 扩增。设置以水为模板的阴性对照，以病毒为模板的阳性对照。产物电泳，或 产物读数。最小有效取样量的确证在阴性对照和阳性对照都成立的情况下，样品扩增产物可同时满足以下三点要求
12、的最小有效取样量：）取样量可保证提取过程正常完成；）扩增出的目的条带亮度不低于分子量标准（上样量，浓度约 ）的条带亮度；）检测结果的 值介于 之间。假病毒均匀性检测 检测方法 以初始样、中间样、终止样三阶段分别随机抽取共 份假病毒样品。依据同人同机原则，分别提取 份样品的。分别以 份假病毒为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行 或 扩增，每份样品做个平行对照，取平均 值。产物电泳，或 产物读数并计算变异系数。假病毒均匀性判定判定标准如下：）份假病毒样品的检测结果全部为阳性，且 扩增的 条条带亮度相同；或 得出的 份样品 值变异系数，则表明假病毒样品均匀性良好；）有样品为弱阳性或阴
13、性；或 份样品 值变异系数，则表明假病毒样品均匀性不良，需重新混匀分装。假病毒稳定性检测 假病毒温度稳定性检测设置组假病毒样品，分别放置于和 保存。分别在第天、第天、第天、第天、第周、第周、第月和第年时间段，每组各取支样品，个样品应至少设三个重复，取 假病毒溶液提取，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行检测。假病毒犚犖犪 狊 犲耐受性检测根据假病毒中病毒的浓度，取假病毒溶液，含病毒约；加入 ，孵育，孵育温度根据 说明书设置。取 假病毒溶液提取，进行 或 犌犅犜 检测。假病毒稳定性判定假病毒经以下种方法平行处理后，或 检测结果仍为阳性，说明稳定性良好，否则需重新制备假病毒：）至少保存；）
14、至少保存年；）处理。假病毒的保存低于 条件下保存时间不超过年，避免反复冻融；条件下保存时间不超过。假病毒的验证假病毒作为水生动物病毒核酸检测参考物质，经过至少家具备核酸提取和分子生物学检测能力的水生动物检测实验室平行测定。测定内容包括病毒目的片段的特异性、定性检测、定量检测等。定性检测要求检测结果为阳性，定量检测要求 值误差不超过。测定结果都合格后，才能投入使用。假病毒质量评价方法经 步骤检测，假病毒应同时满足以下点要求，才能作为水生动物病毒核酸检测参考物质使用：）外膜蛋白包裹病毒目的片段，扩增片段序列与相应病毒的参考毒株序列同源性不低于；）假病毒溶液中和外膜蛋白里都不含有病毒；）最小有效取样
15、量能同时满足提取和 或 的需求；）同批次样品均匀性良好，检测结果基本一致；）保存，保存年，检测结果仍为阳性；）拥有一定的核酸酶耐受性，处理后仍可使用；）经过至少家水生动物疫病研究实验室的平行测定，且测定结果全部合格。犌犅犜 附录犃（资料性）基 因 序 列假病毒载体中插入的 基因（，成熟蛋白编码基因、衣壳蛋白编码基因和衣壳蛋白编码基因下游影响噬菌体包装的 发夹结构），全长 。犌犅犜 附录犅（规范性）假病毒制备方法犅 试剂或材料犅 水：商品化试剂。犅 凝胶回收试剂、原核表达系统、酵母表达系统、真核表达系统：商品化试剂盒。犅 质粒载体：载体，商品化试剂。犅 假病毒质粒载体：由使用实验室自己合成，或采
16、购其他实验室已经构建的载体。载体多克隆位点中应成功插入 蛋白基因片段，基因方向应正确，也可再插入 基因，使表达出的假病毒外膜蛋白包含 标签，可使用 亲和层析法纯化。犅 ：含、各 ，保存，避免温度剧烈变化。犅 犜犪 狇聚合酶：，保存，避免温度剧烈变化。犅 逆转录酶：，保存，避免反复冻融和温度剧烈变化。犅 病毒目的的扩增引物：可参照相应的国家标准或行业标准合成。犅 连接酶：，保存，避免温度剧烈变化。犅 限制性内切酶：保存，避免温度剧烈变化。犅 ：，按照 配制。犅 ：，按照 配制。犅 培养基：按照 配制。犅 、：商品化试剂。犅 溴化乙锭：，按照 配制，也可选择商品化试剂。犅 电泳缓冲液：按照 配制，也可选择商品化试剂。犅 上样缓冲液：按照 配制，也可选择商品化试剂。犅 灭活处理的管、试管、管、移液器枪头：商品化耗材。犅 仪器设备犅 水浴锅。犅 恒温摇床。犅 超净工作台。犅 冷冻高速离心机。犅 电子天平。犅 高压灭菌锅。犅 仪。犅 电泳仪。犅 荧光定量仪。犅 紫外分光光度计。犅 凝胶成像系统。犅 移液器。犌犅犜 犅 假病毒参考物质的制备犅 病毒总犚犖犃的提取按照待检目的病毒检测的国家标准或行业