1、I C S6 7.0 5 0C C SX0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 4 3 82 0 2 2 出口乳粉中核苷酸含量的测定 液相色谱-质谱/质谱法D e t e r m i n a t i o n o f n u c l e o t i d e i n m i l k p o w d e r f o r e x p o r tL C-M S/M S m e t h o d2 0 2 2-0 3-1 4发布2 0 2 2-1 0-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第
2、1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国广州海关、广州医科大学。本文件主要起草人:丁博、董洁、李荀、曾广丰、王璐、谢建军、陈文锐。S N/T5 4 3 82 0 2 2以正式出版文本为准以正式出版文本为准出口乳粉中核苷酸含量的测定液相色谱-质谱/质谱法1 范围本文件规定了游离核苷酸含量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本文件适用于乳粉和调制乳粉中游离核苷酸总量(包括胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸5种核苷酸)的测定。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文
3、件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件,不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B 1 9 6 4 42 0 1 0 食品安全国家标准 乳粉3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1乳粉 m i l k p o w d e r以生羊、牛乳为原料,经加工制成的粉状产品(见G B 1 9 6 4 42 0 1 0)。3.2调制乳粉 f o r m u l a t e d m i l k p o w d e r 以生牛(羊)乳或及其加工制品为主要原料,添加其他原料,添加或不添加
4、食品添加剂和营养强化剂,经加工制成的乳固体含量不低于7 0%的粉状产品(见G B 1 9 6 4 42 0 1 0)。3.3游离核苷酸 f r e e n u c l e o t i d e以核苷酸分子独立形态存在生物体内的物质,包括胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸5种核苷酸。3.4蛋白质沉淀 p r o t e i n p r e c i p i t a t i o n一种样品前处理方法。通过向样品中加入可混溶的有机溶剂致使蛋白质沉淀。3.5多反应监测 m u l t i p l e r e a c t i o n m o n i t o r i n g
5、(MRM)一种在串联质谱中使用的定量分析方法,通过在串联质谱仪的第一级(Q 1)锁定母离子并在第三级(Q 3)锁定子离子来测定分析物。1S N/T5 4 3 82 0 2 2以正式出版文本为准4 方法提要采用水提取试样中的核苷酸,甲酸沉淀蛋白质后,液相色谱-质谱/质谱仪检测和确证,外标法定量。5 试剂和材料水采用G B/T 6 6 8 2规定的一级水。5.1 乙腈:色谱纯。5.2 甲酸:色谱纯。5.3 1%甲酸水溶液:准确吸取1 0 m L甲酸(4.2),用水定容至1 L,混匀。5.4 0.1%甲酸水溶液:准确吸取1 m L甲酸(4.2),用水定容至1 L,混匀。5.5 标准物质:核苷酸标准品
6、(具体信息参见附录A),纯度均大于9 9%。胞嘧啶核苷酸C y t i d i n e m o n o p h o s p h a t e(CMP)C9H1 4N3O8P腺嘌呤核苷酸A d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e(AMP)C1 0H1 4N5O7P尿嘧啶核苷酸U r i d i n e m o n o p h o s p h a t e(UMP)C9H1 3N2O9P鸟嘌呤核苷酸G u a n o s i n e m o n o p h o s p h a t e(GMP)C1 0H1 4N5O8P次黄嘌呤核苷酸I n o s i n e
7、 m o n o p h o s p h a t e(I MP)C1 0H1 3N4O8P5.6 标准储备液的配制:分别准确称取经纯度折算后的适量标准物质(精确到0.1 m g),用水溶解,难溶的标准品,加少量1%甲酸水溶液(4.3)溶解,再用水定容至刻度,配制成浓度为1.0 m g/m L的标准储备溶液。于4 以下避光保存,有效期6个月。5.7 混合标准溶液的配制:准确吸取标准储备液0.5 m L于1 0 m L 容量瓶中,用水定容至刻度,此标准溶液浓度为5 0.0 m g/L,于4 以下冰箱内储存,有效期1个月。5.8 微孔滤膜:0.2 2 m,有机相型。6 仪器和设备6.1 液相色谱-质
8、谱/质谱联用仪:配有电喷雾离子源(E S I)。6.2 超声波水浴。6.3 涡旋混合器。6.4 低温离心机:可制冷至4,1 0 0 0 0 r/m i n。6.5 均质器。6.6 分析天平:感量0.1 m g和0.0 0 1 g。6.7 聚丙烯离心管:5 0 m L,具塞。6.8 移液枪,1 0 L1 0 0 0 L,1 0 L1 0 0 L,1 0 0 0 L5 0 0 0 L。7 测定步骤7.1 提取称取5.0 g均匀样品(精确至0.0 1 g),加3 0 m L水,振荡、超声至完全溶解,转移至1 0 0 m L容量瓶中,定容至刻度;取2 0 m L样品溶液转移至5 0 m L容量瓶中,定
9、容至刻度,获得稀释样品溶液;取5 m L稀释试样于5 0 m L容量瓶,加入1 2 0 L1 5 0 L 1%甲酸溶液(4.3),超纯水定容至刻度线,置于超声波清洗器中超声波提取1 0 m i n后(调制乳粉样品不超声直接静止3 0 m i n,提取核苷酸),在4 下离心2S N/T5 4 3 82 0 2 2以正式出版文本为准2 0 m i n(转速1 0 0 0 0 r/m i n)。吸取上清液,用0.2 2 m滤膜(4.9)过滤,待液相色谱-质谱/质谱仪测定。7.2 混合标准工作溶液的配制用水将核苷酸混合标准溶液(4.7)分别稀释为0.0 2 5 g/m L、0.0 5 g/m L、0.
10、1 g/m L、0.2 g/m L、0.4 g/m L、0.8 g/m L、1.0 g/m L的系列标准工作液。7.3 测定7.3.1 液相色谱参考条件7.3.1.1 色谱柱C1 8色谱柱,1 0 0 mm4.6 mm(内径),3.5m,或相当者。7.3.1.2 柱温柱温:4 0。7.3.1.3 进样量进样量:1 0 L。7.3.1.4 梯度洗脱流动相、流速及梯度洗脱条件见表1。表1 流动相、流速及梯度洗脱条件时间/m i n流速/(L/m i n)0.1%甲酸水溶液/%乙腈/%05 0 09 913.55 0 09 914.05 0 01 09 055 0 01 09 05.55 0 09
11、917.3.2 质谱参考条件7.3.2.1 离子化模式电喷雾离子源(E S I),E S I+模式。7.3.2.2 扫描方式多反应监测(MRM)。7.3.2.3 分辨率单位分辨率。3S N/T5 4 3 82 0 2 2以正式出版文本为准7.3.2.4 其他参考条件其他参考条件参见附录B。7.4 定性在相同实验条件下,样品中待测物质的保留时间,与基质标准溶液的保留时间偏差在2.5%之内;每种化合物的质谱定性离子至少应包括一个母离子和两个子离子,且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较,偏差不超过表2规定的范围,则可判定为样品中存在对应的
12、待测物。表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%5 02 05 01 02 01 0允许的最大偏差/%2 02 53 05 07.5 定量待测样液中核苷酸的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应稀释后再进样分析。核苷酸标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图参见附录C。8 结果计算和表述8.1 试样中游离核苷酸各组分的含量试样中游离核苷酸各组分的含量X(CMP、UMP、GMP、I MP、AMP)分别按公式(1)计算:X=CiVinmi1 0 0 01 0 0(1)式中:X 试样中核苷酸各组分的含量(分别是:CMP、UMP、GMP、I MP、AMP),单位为毫克每百克(m
13、g/1 0 0 g);Ci 试样溶液中核苷酸各组分的浓度,单位为微克每毫升(g/m L);Vi 试样溶液的体积,单位为毫升(m L);mi 试样的质量,单位为克(g);n 样液稀释倍数。8.2 试样中游离核苷酸的总量试样中游离核苷酸的总量按公式(2)计算:Z=CMP+AMP+UMP+GMP+I MP(2)式中:Z 试样中游离核苷酸的总量,单位为毫克每百克(m g/1 0 0 g);CMP 按公式(1)计算出的游离胞嘧啶核苷酸含量,单位为毫克每百克(m g/1 0 0 g);AMP 按公式(1)计算出的游离腺嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(m g/1 0 0 g);UMP 按公式(1)计算出的
14、游离尿嘧啶核苷酸含量,单位为毫克每百克(m g/1 0 0 g);GMP 按公式(1)计算出的游离鸟嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(m g/1 0 0 g);4S N/T5 4 3 82 0 2 2以正式出版文本为准I MP 按公式(1)计算出的游离次黄嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(m g/1 0 0 g)。9 方法的定量限和回收率9.1 定量限本标核苷酸各组分定量限见表3。表3 核苷酸的定量限名称CMPAMPUMPGMPI MP定量限/(m g/k g)0.40.53.45.02.69.2 回收率与重复性在3个添加浓度范围内,乳粉(全脂乳粉、脱脂乳粉)和调制乳粉的回收率与重复性数据见附
15、录D。5S N/T5 4 3 82 0 2 2以正式出版文本为准附 录 A(资料性)核苷酸的标准信息核苷酸的标准信息见表A.1。表A.1 核苷酸的标准信息表中文名称英文名称分子式相对分子质量结构式C A S号胞嘧啶核苷酸C y t i d i n e m o n o p h o s-p h a t e(CMP)C9H14N3O8P3 2 3.0 56 3-3 7-6腺嘌呤核苷酸A d e n o s i n e m o n o-p h o s p h a t e(AMP)C1 0H1 4N5O7P3 4 7.0 66 1-1 9-8尿嘧啶核苷酸U r i d i n e m o n o p h
16、 o s-p h a t e(UMP)C9H1 3N2O9P3 2 4.0 35 8-9 7-9鸟嘌呤核苷酸G u a n o s i n e m o n o-p h o s p h a t e(GMP)C1 0H1 4N5O8P3 6 3.0 58 5-3 2-5次黄嘌呤核苷酸I n o s i n e m o n o p h o s-p h a t e(I MP)C1 0H1 3N4O8P3 4 8.0 41 3 1-9 9-76S N/T5 4 3 82 0 2 2以正式出版文本为准附 录 B(资料性)参考质谱条件1)1)非商业性声明:附录A所列参考质谱条件是在A P I 4 0 0 0型液质联用仪上完成的,此处列出试验用仪器型号仅为提供参考,并不涉及商业目的,鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器。B.1 参考质谱条件如下:a)电喷雾电压:4 5 0 0 V;b)辅助气压力:4 5 p s i;c)雾化气压力:4 5 p s i;rd)气帘气压力:3 5 p s i;e)离子源温度:4 5 0;f)碰撞气:氮气;g)定性离子对、定量离子对、保留时间、锥孔电压及碰撞能量见表B.1