1、中华人民共和国国家生态环境标准 HJ 12152021 水质 浮游植物的测定 滤膜-显微镜计数法 Water qualityDetermination of phytoplankton Filtration membrane-Microscope counting method 本电子版为正式标准文本，由生态环境部环境标准研究所审校排版。2021-11-29 发布 2022-06-01 实施 生 态 环 境 部 发 布 HJ 12152021 i 目 次 前 言.ii 1 适用范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方法原理.1 5 试剂和材料.2 6 仪器和设备.2 7 样
2、品.3 8 分析步骤.4 9 结果计算与表示.6 10 精密度.6 11 质量保证和质量控制.7 12 废物处置.7 附录 A（规范性附录）方法检出限计算方法.8 附录 B（资料性附录）惠普尔目镜分划板标定.9 附录 C（资料性附录）丝状体、似球形群体浮游植物细胞数量估算.12 参考文献.13 HJ 12152021 ii 前 言 为贯彻中华人民共和国环境保护法 中华人民共和国水污染防治法，防治生态环境污染，改善生态环境质量，规范水中浮游植物的测定方法，制定本标准。本标准规定了测定地表水中浮游植物的滤膜-显微镜计数法。本标准的附录 A 为规范性附录，附录 B 和附录 C 为资料性附录。本标准为
3、首次发布。本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准主要起草单位：浙江省生态环境监测中心。本标准验证单位：上海市环境监测中心、浙江省海洋监测预报中心、浙江省杭州生态环境监测中心、浙江省宁波生态环境监测中心、江苏省常州环境监测中心和自然资源部第二海洋研究所。本标准生态环境部 2021 年 11 月 29 日批准。本标准自 2022 年 6 月 1 日起实施。本标准由生态环境部解释。HJ 12152021 1 水质 浮游植物的测定 滤膜-显微镜计数法 1 适用范围 本标准规定了测定水中浮游植物的滤膜-显微镜计数法。本标准适用于地表水中浮游植物的快速测定。当样品最大过滤体积为 1
4、000 ml 时，方法检出限为 40 cells/L。方法检出限计算方法详见附录 A。2 规范性引用文件 本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导 HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 HJ 494 水质 采样技术指导 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 浮游植物 phytoplankton 在水中营浮游生活的微小藻类植物，通常浮游植物就是浮游藻类，包括原核的蓝藻和其它各类真核藻类。3.2 计数单位 counti
5、ng unit 显微镜视野下选择计数的最小单元，如细胞。3.3 浮游植物密度 density of phytoplankton 单位体积内浮游植物的细胞数，cells/L。3.4 显微镜计数视野 microscope counting field 显微镜视野中限定一定面积的区域，用来定量计数浮游植物。4 方法原理 样品通过一定孔径的滤膜，群体、丝状体及单细胞浮游植物截留在滤膜上，滤膜经透明处理后在显微镜下镜检。HJ 12152021 2 5 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为新制备的去离子水或蒸馏水。5.1 碘（I2）。5.2 碘化钾（KI）。5.3 甲
6、醛溶液：w(HCHO)37%40%。5.4 鲁哥氏碘液：称取 60 g 碘化钾（5.2）溶解在 100 ml 水中，再加入 40 g 碘（5.1），充分搅拌使其完全溶解，加水定容至 1000 ml，转移至棕色磨口玻璃瓶，室温避光保存。5.5 显微镜浸没油：nD23=1.515 或nE23=1.518，配透明玻璃滴棒。5.6 滤膜：混合纤维素酯膜，直径 25 mm，孔径 0.45 m3 m。注：每批次滤膜应进行水化测试和油透明测试，满足可水化和可透明要求后方可使用。将 1 张未使用的滤膜放入盛水的烧杯中，若滤膜被水完全浸润，则滤膜可水化。取 1 张未使用的滤膜，置于滴有显微镜浸没油的载玻片上，若
7、滤膜被浸没油完全浸润，则滤膜可透明。6 仪器和设备 6.1 25 号浮游生物网：网孔直径 0.064 mm，网呈圆锥形，网口套在铜环上，网底端有出水开关活塞。6.2 定性采样瓶：30 ml100 ml 广口聚乙烯瓶。6.3 采水器：不锈钢或有机玻璃材质，圆柱形。容量和深度规格要满足采样要求。6.4 定量采样瓶：1 L2 L 广口聚乙烯瓶。6.5 冷藏箱。6.6 真空抽滤装置：包括漏斗（直径 25 mm，容积 200 ml）、多孔聚酯滤膜支撑板、收集瓶、真空泵（相对真空度17 kPa，可调）。6.7 载玻片：25 mm76 mm。注：载玻片和盖玻片使用前应用浓盐酸和乙醇浸泡。若条件允许，选择可直
8、接使用的载玻片或盖玻片。6.8 盖玻片：25 mm25 mm。6.9 无齿组织镊子。6.10 载玻片晾片板：适配同规格载玻片。6.11 烘箱：70 2，温度可调。6.12 正置生物显微镜或倒置生物显微镜：物镜 4、10、20、40；目镜 10或 15。6.13 载物台测微计：又称镜台测微计，1 mm/100 DIV，分划值为 0.01 mm。注：DIV 指等分格，1 mm/100 DIV 即 1 mm 等分成 100 格。6.14 惠普尔目镜分划板（Whipple grid）：边长为 7 mm10 mm 的正方形大格，划分为 100 个相同的正方形中格，位于中央的 1 个中格进一步划分为 25
9、 个相同的正方形小格。注：不具备惠普尔目镜分划板时，亦可使用同规格的网格型目镜分划板（即中央的中格未细分为 25 小格的网格型目镜分划板）。6.15 计数器。6.16 一般实验室常用设备。HJ 12152021 3 7 样品 7.1 样品采集 7.1.1 定性样品 点位布设及采样频次按照 GB/T 14581、HJ/T 91 和 HJ 494 的相关规定执行。使用 25 号浮游生物网（6.1）采集定性样品。关闭浮游生物网底端出水活塞开关，在水面表层至0.5 m 水深处以 20 cm/s30 cm/s 的速度做“”形往复，缓慢拖动约 1 min3 min，待网中明显有浮游植物进入，将浮游生物网（
10、6.1）提出水面，网内水自然通过网孔滤出，待底部剩少许水样（5 ml10 ml）时，将底端出口移入定性采样瓶（6.2）中，打开底端活塞开关收集定性样品。采集分层样品时，用 25 号浮游生物网（6.1）过滤特定水层样品，其他步骤同采集表层样品。定性样品采集完成后及时将浮游生物网清洗干净。样品采集后放入冷藏箱（6.5）冷藏避光运输。如有定性样品采集技术规范，按技术规范有关要求执行。7.1.2 定量样品 按照 GB/T 14581、HJ/T 91 和 HJ 494 的相关规定采集定量样品。使用采水器（6.3）采集 1 L2 L 样品至定量采样瓶（6.4）中。若水体透明度较高，浮游植物数量较少时，应酌
11、情增加采样体积。定量样品采集完成后，定量采样瓶（6.4）不应装满，以便摇匀。注 1：有些浮游植物（如蓝藻）常上浮在水面或成片、条带分布，可在此水华密集区域采样作为峰值参考。注 2：定量样品采集应在定性样品采集之前。应保持固定时间段采样，以便结果之间可相互比较。7.2 样品保存 7.2.1 定性样品 定性样品采集后应立即加入鲁哥氏碘液（5.4）固定，用量为水样体积的 1.0%1.5%。镜检活体样品不加鲁哥氏碘液（5.4）固定。定性样品在室温避光条件下可保存 3 周；1 5 冷藏避光条件下可保存 12 个月。活体样品 4 10 冷藏避光条件下可保存 36 h。7.2.2 定量样品 定量样品采集后立
12、即加入鲁哥氏碘液（5.4）固定，用量为水样体积的 1.0%1.5%。也可将鲁哥氏碘液（5.4）提前加入定量采样瓶（6.4）中带至现场使用。定量样品在室温避光条件下可保存 3 周；1 5 冷藏避光条件下可保存 12 个月。样品在保存过程中，应每周检查鲁哥氏碘液（5.4）的氧化程度，若样品颜色变浅，应向样品中补加适量的鲁哥氏碘液（5.4），直到样品的颜色恢复为黄褐色。注：若样品需长期保存，应加入甲醛溶液（5.3），用量为水样体积的 4%。HJ 12152021 4 8 分析步骤 8.1 试样制备 8.1.1 预检 按照 8.1.28.1.5 的要求完成预检装片，判断样品浮游植物密度，便于样品的后续
13、分析。8.1.2 混匀样品 每次取样前，采用上下颠倒至少 30 次的方式充分混匀样品，混匀动作要轻。8.1.3 过滤体积 根据预检估算浮游植物密度，调整样品过滤体积，最终使滤膜上约有 40 个105个浮游植物细胞。不同预检估计密度水平下推荐的样品过滤体积见表 1。表 1 推荐选用的样品过滤体积 预估浮游植物细胞密度水平（cells/L）推荐的样品过滤体积 V0（ml）108及以上 0.52 107 510 106 525 105 1050 104 5100 103 50200 102 500 40 1000 注 1：样品过滤体积大于漏斗容量时，应保证后续样品加入时不扰动滤膜上的浮游植物。注 2
14、：样品过滤体积小于 5 ml 时，以实验用水再悬浮样品。首先用移液器（6.16）量取一定体积的样品至 10 ml50 ml 规格的离心管中，再加入一定体积的实验用水，使悬浮后样品总体积在 5 ml 及以上即可，最后用胶头滴管（6.16）加入 2 滴3 滴鲁哥氏碘液（5.4）固定。8.1.4 样品过滤 用量筒或移液器（6.16）快速量取适量样品体积，将样品加入装有滤膜（5.6）的真空抽滤装置（6.6）漏斗中，静置 2 min3 min，真空抽滤，至漏斗中有 0.5 cm 液层时关闭真空泵，使剩余液体完全通过漏斗，切忌抽干滤膜。8.1.5 装片制备 样品过滤完成后，用无齿组织镊子（6.9）取下滤膜
15、，保持截留浮游植物的一面向上，放在滴有 2 滴显微镜浸没油（5.5）的载玻片（6.7）上，再用透明玻璃滴棒在滤膜上滴 2 滴显微镜浸没油（5.5），将载玻片（6.7）放入载玻片晾片板（6.10），置于烘箱（6.11）中，70 2 加热 2 h。2 h 后取出载玻片晾片板（6.10），观察滤膜是否透明。若已透明，再在滤膜上滴加 2 滴显微镜浸没油（5.5），盖上盖玻片HJ 12152021 5（6.8），装片制备完成。若滤膜加热 2 h 后未透明，延长加热时间，不超过 24 h。盖上盖玻片（6.8）时，勿扰动滤膜。8.2 定性样品分析 在显微镜（6.12）下观察定性样品，鉴定浮游植物的种类。优势
16、种类鉴定到种，其他种类至少应鉴定到属。部分鉴定参考资料见参考文献。注：种类鉴定除用定性样品观察外，还可吸取已完成计数的定量样品进行观察。8.3 定量样品分析 8.3.1 显微镜标定 计数前标定显微镜（6.12），确定计数视野面积（Whipple 视野或目镜视场视野）。显微镜标定工具包括载物台测微计（6.13）和惠普尔目镜分划板（6.14）。惠普尔目镜分划板标定方法参见附录 B。8.3.2 显微镜计数 不同密度水平样品推荐视野类别及计数视野数量见表 2。将装片（8.1.5）置于显微镜（6.12）载物台上，用 Whipple 视野或目镜视场视野进行镜检计数。较低密度水平样品计数，建议选择目镜视场视野计数。根据浮游植物细胞大小，选择目镜 10、物镜 20或目镜 10、物镜 40放大倍数镜检，记录每个视野的浮游植物种类及数量。表 2 不同密度水平样品推荐视野类别及计数视野数 样品 推荐计数视野类别 推荐计数视野数 高密度水平（108 cells/L及以上）Whipple视野 10个 中密度水平（106 cells/L107 cells/L）Whipple视野 20个 低密度水平（106 cel