1、I C S6 7.0 5 0C C S C 5 3中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 4 3 72 0 2 2 出口动物源食品中苯海拉明残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法D e t e r m i n a t i o n o f d i p h e n h y d r a m i n e r e s i d u e i n f o o d s t u f f s o f a n i m a lo r i g i n f o r e x p o r tL C-M S/M S m e t h o d2 0 2 2-0 3-1 4发布2 0 2 2-1 0-0 1实施中华人民共和国海关
2、总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国合肥海关技术中心、中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国天津海关。本文件主要起草人:吕亚宁、韩芳、郑平、王萍、张利刚、宋伟、丁磊、周典兵、盛旋。以正式出版文本为准以正式出版文本为准出口动物源食品中苯海拉明残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法1 范围 本文件规定了出口动物源食品中苯海拉明残留量
3、的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本文件适用于猪肉、牛肉、羊肉、猪肝、猪肾、猪肠和牛奶等动物源性食品中苯海拉明残留量的定量测定和确证。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 方法提要 试样中的苯海拉明用三氯乙酸-乙腈溶液提取,提取液经强阳离子交换固相萃取柱净化,液相色谱-质谱/质谱仪测定,内标法定量。5 试剂和材料 除非另有说明,
4、所用试剂均为分析纯,水为G B/T 6 6 8 2规定的一级水。5.1 乙腈:色谱纯。5.2 甲醇:色谱纯。5.3 甲酸:色谱纯。5.4 正己烷:色谱纯。5.5 三氯乙酸。5.6 氨水:含量为2 5%2 8%。5.7 苯海拉明标准物质:C1 7H2 2C l NO,C A S号.1 4 7-2 4-0,纯度大于等于9 9%。5.8 氘代苯海拉明标准溶液:C1 7H1 8D3NO,C A S号.1 7 0 0 8 2-1 8-5,1 0 0 g/m L。5.9 1%三氯乙酸溶液:称取1 0 g三氯乙酸(4.5),用水溶解,定容至1 0 0 0 m L,混匀。5.1 0 1%三氯乙酸-乙腈溶液(3
5、+7,体积比):量取3 0 0 m L 1%三氯乙酸溶液(4.9)和7 0 0 m L乙腈(5.1),混匀,现用现配。5.1 1 2 0%氨水甲醇溶液:量取2 0 m L氨水(5.6)和8 0 m L甲醇(5.2),混匀。1S N/T5 4 3 72 0 2 2以正式出版文本为准5.1 2 0.1%甲酸溶液:量取1.0 m L甲酸(5.3),用水定容至1 0 0 0 m L,混匀。5.1 3 0.1%甲酸-乙腈溶液(9 5+5,体积比):量取5 m L乙腈(5.1),用0.1%甲酸溶液(5.1 2)定容至1 0 0 m L。5.1 4 苯海拉明标准储备液:准确称取适量盐酸苯海拉明标准品(5.7
6、),用少量水溶解后,再用乙腈(5.1)定容,配制成浓度为1 0 0 m g/L的标准储备液,于0 4 冷藏避光保存,有效期6个月。5.1 5 苯海拉明标准中间液:准确吸取苯海拉明标准储备液(5.1 4)1 m L于1 0 0 m L容量瓶中,用乙腈(5.1)定容至刻度,配制成浓度为1 m g/L的标准中间液,于0 4 冷藏避光保存,保存期3个月。5.1 6 苯海拉明-D3内标工作液:准确吸取苯海拉明-D3标准溶液(5.8)0.5 m L于1 0 0 m L容量瓶中,用乙腈(4.1)定容至刻度,配制成浓度为5 0 0 g/L的内标工作液,于0 4 冷藏避光保存,保存期3个月。5.1 7 标准工作
7、溶液:准确吸取一定量苯海拉明标准中间液(5.1 5)和苯海拉明-D3内标工作液(5.1 6),用0.1%甲酸溶液-乙腈溶液(5.1 3)配制成浓度分别为1 g/L、2 g/L、5 g/L、1 0 g/L、5 0 g/L的系列标准工作液(苯海拉明-D3的内标浓度为1 0 g/L),于0 4 冷藏避光保存,保存期1个月。5.1 8 C NWB ON D S C X固相萃取柱:苯磺酸型强阳离子交换柱,5 0 0 m g,6 m L,或相当者。使用前依次用5 m L甲醇、5 m L水和5 m L 1%三氯乙酸溶液-乙腈溶液(5.1 0)活化,保持柱体湿润。5.1 9 微孔滤膜:通用型,0.2 2 m。
8、6 仪器和设备6.1 液相色谱-质谱/质谱仪,配电喷雾离子源(E S I)。6.2 分析天平:感量分别为0.0 0 0 1 g和0.0 1 g。6.3 组织捣碎机。6.4 均质器:转速不低于1 0 0 0 0 r/m i n。6.5 超声波振荡器。6.6 冷冻离心机:转速不低于8 0 0 0 r/m i n。6.7 固相萃取装置。6.8 氮吹仪。6.9 涡旋混合器6.1 0 p H计。6.1 1 离心管:聚乙烯,具塞,5 0 m L。6.1 2 比色管:2 5 m L。7 试样的制备和保存7.1 猪肉、牛肉、羊肉、猪肝、猪肾和猪肠 取有代表性样品约5 0 0 g,用组织捣碎机充分捣碎,均分成两
9、份,分别装入洁净的容器内,密封并标明标记。如非立即进行前处理,于-1 8 下冷冻保存。7.2 牛奶取有代表性样品约5 0 0 g,充分混匀,均分成两份,分别装入洁净容器,密封并标明标记,于0 4 冷藏保存。2S N/T5 4 3 72 0 2 2以正式出版文本为准8 测定步骤8.1 提取与净化8.1.1 猪肉、牛肉、羊肉、猪肝、猪肾和猪肠 称取约2 g试样(精确到0.0 1 g)于5 0 m L具塞离心管中,准确加入1 0 0 L苯海拉明-D3内标工作液(5.1 6)和2 0 m L 1%三氯乙酸-乙腈溶液(5.1 0),1 0 0 0 0 r/m i n均质提取1 m i n,再超声提取1
10、5 m i n,于转速8 0 0 0 r/m i n,温度4 以下,离心1 0 m i n。收集上清液于 2 5 m L比色管(5.1 2)中,用氨水(5.6)调节p H至5,加水定容至2 5 m L,待净化。精确移取5 m L提取液,以不超过1 m L/m i n 的流速通过已活化的S C X固相萃取柱(5.1 8),待样液全部通过后,依次用5 m L水、5 m L甲醇(5.2)淋洗小柱,弃去全部流出液,减压抽至近干。先后用6 m L 2 0%氨水甲醇溶液(5.1 1)和4 m L乙腈(5.1)洗脱,收集全部洗脱液,于4 0 下氮气吹干,准确加入1.0 m L 0.1%甲酸-乙腈溶液(5.1
11、 3)溶解残渣,过0.2 2 m 微孔滤膜(5.1 9),供液相色谱-质谱/质谱仪测定。8.1.2 牛奶 称取约2 g试样(精确到0.0 1 g)于5 0 m L具塞离心管中,准确加入2 0 L苯海拉明-D3内标工作液(5.1 6)和1 5 m L 1%三氯乙酸-乙腈溶液(5.1 0),超声提取1 5 m i n。提取液用氨水(5.6)调节p H至5,待净化。将全部提取液以不超过1 m L/m i n 的流速通过已活化的S C X固相萃取柱(5.1 8),待样液全部通过后,依次用5 m L 水、5 m L甲醇(5.2)淋洗小柱,弃去全部流出液,减压抽至近干。先后用6 m L 2 0%氨水甲醇溶
12、液(5.1 1)和4 m L乙腈(5.1)洗脱,收集全部洗脱液,于4 0下氮气吹干,准确加入1.0 m L 0.1%甲酸-乙腈溶液(5.1 3)溶解残渣,过0.2 2 m 微孔滤膜(5.1 9),供液相色谱-质谱/质谱仪测定。8.2 测定8.2.1 液相色谱条件 液相色谱条件参考如下:a)液相色谱柱:C1 8柱,1.8 m,2.1 mm5 0 mm(内径)或相当者;b)柱温:3 0;c)流速:0.3 m L/m i n;d)流动相:A为0.1%甲酸水溶液,B为乙腈,流动相梯度洗脱程序见表1。e)进样量:5 L。表1 流动相梯度洗脱程序时间/m i nA/%B/%0.0 09 5.0 05.0
13、01.0 09 5.0 05.0 02.0 06 0.0 04 0.0 04.0 06 0.0 04 0.0 04.0 19 5.0 05.0 05.0 09 5.0 05.0 03S N/T5 4 3 72 0 2 2以正式出版文本为准8.2.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下:a)离子源:电喷雾离子源(E S I);b)扫描方式:正离子扫描;c)检测方式:多反应监测模式(MRM);d)雾化气、气帘气、辅助加热气和碰撞气均为高纯氮气;使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求;喷雾电压、去簇电压、碰撞能量等参数应优化至最优灵敏度,质谱参考参数参见附录A。8.2.3 液相色谱-串联质谱测
14、定8.2.3.1 定性测定按照液相-质谱/质谱条件测定标准工作溶液和待测液。如果待测液中检测的质量色谱峰保留时间与标准品的保留时间偏差在2.5%之内;定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准工作液的相对丰度一致,相对丰度偏差不超过表2的规定,且定性离子对的信噪比均 3,则可判断样品中存在对应的被测物。表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对丰度/%5 02 05 01 02 01 0允许的相对偏差/%2 02 53 05 08.2.3.2 定量测定 将标准工作溶液和待测液依次注入液相色谱-质谱/质谱仪中进行分析,标准工作溶液和待测液中苯海拉明和苯海拉明-D3的响应值均应在仪器线性响应范围内。
15、在上述仪器条件下,苯海拉明标准溶液的多反应监测色谱图参见附录B。8.3 空白试验 除不称取试样外,按上述试样测定步骤进行。9 结果计算和表述 采用标准工作曲线定量,试样中苯海拉明的含量由液相色谱-质谱/质谱仪的数据处理软件或按公式(1)计算,计算结果需扣除空白值:X=CVf1 0 0 0m1 0 0 0(1)式中:X 试样中被测组分含量,单位为微克每千克(g/k g);C 从标准工作曲线得到的样液中被测组分溶液浓度,单位为微克每升(g/L);V 最终样液的定容体积,单位为毫升(m L);m 试样质量,单位为克(g);f 稀释倍数(牛奶等液体为1,其他为5)。注:结果保留3位有效数字。4S N/
16、T5 4 3 72 0 2 2以正式出版文本为准1 0 定量限和回收率1 0.1 定量限 猪肉、牛肉、羊肉、猪肝、猪肾和猪肠中苯海拉明的定量限为:5 g/k g。牛奶中苯海拉明的定量限为:1 g/k g。1 0.2 回收率 猪肉、牛肉、羊肉、猪肝、猪肾、猪肠和牛奶中苯海拉明的添加水平和回收率数据参见附录C。5S N/T5 4 3 72 0 2 2以正式出版文本为准附 录 A(资料性)质谱参考参数A.1 质谱参考参数:a)扫描方式:E S I正离子模式;b)监测方式:多反应监测(MRM);c)干燥气温度:3 5 0;d)干燥气流速:8 L/m i n;e)气帘气压力:2 7 5.8 k P a;f)鞘气温度:3 5 0;g)鞘气流速:1 2 L/m i n;h)毛细管电压:3 0 0 0 V;i)监测离子对、去簇电压和碰撞能量等见表A.1。表A.1 苯海拉明的质谱参数化合物定性离子对(m/z)定量离子对(m/z)驻留时间/m s去簇电压/V碰撞电压/V苯海拉明2 5 6.0/1 6 7.12 5 6.0/1 6 5.12 5 6.0/1 6 7.12 0 06 064 6苯海拉明-D32